鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量pcr方法的建立

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1、分类号S852.62学校代码10129UDC11.220学号2010201047鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立EstablishmentoftheReal-timeFluorescenceQuantitativePCRtoIdentifyB.abortus,B.melitensis申请人：苏娇学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学指导教师：关平原教授论文提交日期：二〇一三年六月内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的

2、研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作

3、成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：摘要本试验旨在建立准确、快速的检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因，以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志，设计布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的特异性引物和Taqman探

4、针，构建标准阳性质粒模板，优化了多重实时荧光定量PCR反应体系和条件，并将标准阳性质粒10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线，评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性，建立了鉴别牛羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法，并用此方法对临床样品进行检测。结果显示：引物浓度400nM，探针浓度200nM，退火温度60℃为所建立多重实时荧光定量PCR的最佳反应体系和条件。此诊断方法可以特异地检测布鲁菌、牛布鲁菌、羊布鲁菌，不与其它革兰氏阴性细菌发生交叉反应，特别是与布鲁菌有强烈交叉反应的小肠结

5、肠炎耶尔森菌O:9，表明其具有良好的特异性。另外，此诊断方法Cq值的变异系数均小于0.05，检测限为2.8fg～3.2fg，表明其具有良好的可靠性、稳定性及较高的敏感性。运用已建立的诊断方法对临床样品进行检测，其可以准确、快速的检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌。关键词：实时荧光定量PCR；布鲁菌；牛种布鲁菌；羊种布鲁菌；Taqman探针Establishmentofthereal-timefluorescencequantitativePCRtoidentifyB.abortus,B.melitensis

6、AbstractThisstudywasdesignedtoestablishtheaccurateandrapiddetectionmethodofBrucellaspp,Brucellaabortus,Brucellamelitensis.ForBrucellaspp.identification,theprimersandTaqmanprobeweredesignedbasingontheBCSP31gene.ForBrucellastrainidentification,theseprimersan

7、dTaqmanprobesweresetteddependingonthespecificinsertionelementofanIS711.Standardpositiveplasmidtemplateswereconstructedrespectively.Andthereactionsystemandconditionofthemultiplexreal-timefluorescencequantitativePCRwereoptimized.Thestandardpositiveplasmidtem

8、platesofBrucellaspp,Brucellaabortus,Brucellamelitensisweredoneten-foldserialdilutionstomakethemultiplexreal-timefluorescencequantitativePCRstandardcurve.Assessingthesensitivity,specificityandreproducibilityof