拟态弧菌ompu抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析

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1、安徽农业大学硕士学位论文拟态弧菌OmpU抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析姓名：岑峻宇申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李槿年201205摘要水产动物腹水病是由拟态弧菌(所6r面朋砌记螂，‰)引起的危害严重的细菌性疾病【l蚓。目前控制该病的主要手段是抗菌治疗，但是随着抗生素的长期使用，细菌产生耐药性，导致抗菌疗效不明显。因此，研制新型疫苗免疫防治腹水病是一个亟待解决的问题，而寻找保护性抗原表位是生产新型疫苗的基础17培】。拟态弧菌外膜蛋白U(OutermembraneproteinU，OmpU)是一种具有良好抗原性和高度保守性的黏附素蛋白【9

2、。1们，可作为首选疫苗候选分子，但其有效保护性抗原表位至今尚不明确。本研究以纯化的兔抗重组OmpUa多克隆抗体为靶标，应用噬菌体肽库技术筛选和鉴定出拟态弧菌OmpU蛋白的7个免疫优势模拟表位，并分析了模拟抗原表位的免疫原性和免疫保护性，研究结果为进一步研制黏附素表位疫苗奠定了基础。为了获取用于筛选拟态弧菌ompu蛋白的B细胞模拟表位的分子靶标，采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法提纯兔抗重组OmpUa多克隆抗体。纯化的兔抗重组0mpUa抗体的纯度达到95％，浓度为1．5mg／mL，ELISA效价高达1：4096000，完全可用于后续的噬菌体随机肽库筛选试验

3、。为了筛选鉴定OmpU蛋白的B细胞模拟表位，用纯化的兔抗重组OmpUa抗体为筛选靶标，对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗筛选。经过3轮淘洗后，噬菌体的投入产出比呈上升趋势，噬菌体得到较好富集。随机挑选68个噬菌体克隆，经双夹心ELISA和竞争ELISA鉴定出9个阳性噬菌体克隆。提取阳性噬菌体克隆单链DNA进行序列测定与分析，结果显示9个克隆共呈递HDSSKFPYVPSY、FNLHAWPTLDT、HAATVDKIENMR、GLNWSLSPADLI、DTAYEGNIARLM、FSSDSsKVHⅥ)N和SVSEGMKPsPRP7个12肽序列，它们与0mpU蛋白均无

4、3个以上连续的相同氨基酸残基，说明它们是模拟表位。阳性噬菌体克隆C17、C60和C67呈递共同基序DSSK．P，与OmpU蛋白的氨基酸残基(293．316aa)有较高同源性，表明D、S、S、K、P是构成OmpU蛋白B细胞表位的关键氨基酸。使用筛选鉴定的7个噬菌体阳性克隆作为抗原分7组免疫昆明小鼠，每组10只，同时做噬菌体原始肽库阴性对照和拟态弧菌灭活菌体阳性对照。免疫程序为：腹腔免疫，免疫剂量为1012PFU噬菌体／只，首免后14天二免，二免后lO天三免，免疫途径和剂量均同首免。第3次免疫后7天测定出各组免疫小鼠血清中均产生较高滴度的特异性抗体，抗体的EL

5、ISA效价在l：51200～l：409600之间。攻毒试验结果显示，各组免疫小鼠分别获得了70％(7／10，C2l克隆)、80％(8／10，C20和C25克隆)和loo％(10／10，C17、C24、C60和C66克隆)的免疫保护，而噬菌体M13对照组的小鼠全部死亡。说明7个携带ompu蛋白B细胞模拟表位的噬菌体克隆均具有良好的免疫原性和免疫保护性，C17、c24、c60和C66阳性噬菌体克隆所呈递的模拟表位可作为疫苗侯选表位。综上所述，本研究利用噬菌体随机肽库技术首次筛选鉴定了拟态弧菌OmpU蛋白的7个保护性模拟表位，其研究成果拥有自主知识产权，也为设计

6、安全有效的黏附素表位疫苗奠定了坚实的基础。关键词：拟态弧菌，外膜蛋白u，B细胞模拟表位，噬菌体随机肽库技术，免疫保护性lIAbstractTheascitesfluiddiseaseinaquaticanimalsisaseriousimportantdiseasecausedbyVibriomimicus．Antibioticsarecommonlyusedascontrollingthedisease．HoweVer，antibioticresistanceofbacteriaiscausedbylong-timeusingantibiotics，wh

7、ichleadtobadantimicrobialn．eatIllent．Therefore，itisanu唱entproblemfordeVelopmentanewVaccinetocon仃olasciticnuiddiseaseonthebasisoflookingforprotectiVeepitopes．TheoutermembraneproteinU(OmpU)of所6rfD研砌耙”sisaadhesinproteinwithgoodantigenicit)randhighlyconservation，whichcanbeusedasVaccin

8、ecandidate，butitsefrectiVeprotect