解旋酶recql4抗原表位分析及其免疫检测技术的初步建立

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1、万方数据中图分类号：G243UDC：590诃4￡解■q骂二l辟密级：学校代码：硕士学位论文(同等学力)公开10094解旋酶RecQL4抗原表位分析及其免疫检测技术的初步建立AnalysisofAntigenicEpitopesandEstablishmentofImmunoassayMethodforRecQL4作者姓名：指导教师：学科专业名称：研究方向：论文开题日期：吴萌刘敬泽教授闫静辉研究员生态学抗体工程及应用2012年5月12日h拿尢乒D4●-万方数据学位论文原创性声明本人所提交的学位论文《解旋酶RecOL4抗原表位分析及其免疫检测技术的初步建立》，是在导师的指导下，独立进行研

2、究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中标明。本声明的法律后果由本人承担。论文作者c签每蹴乃，铲年少月加日指剥枞c㈣：翊檄浮力，铲年罗月，o日J学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在——年解密后适用本授权书)!搿等磐戒力，P年罗

3、月，汨’指导教师(签名)：张牵2。7争年9具f-o日万方数据摘要ffaston和Crick提出DNA双螺旋结构后，人们逐步发现了DNA聚合酶，它是以一条链为模板通过DNA聚合酶聚合形成一条新的链。科学家后来又发现另一种酶能够在DNA复制时破坏互补碱基对中的氢键，从而使DNA双螺旋打开，这类酶被称为解旋酶，至今已有上百种解旋酶被发现。人们根据解旋酶的二维结构和一级序列，把解旋酶分为几大家族来分类研究。经过多年的研究发现解旋酶具有多种功能，在细胞内它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译，端粒稳定等。最近，还发现个别解旋酶甚至参与机体天然免疫反应机制。解旋

4、酶已不仅仅只是分开核酸双链结构的～类酶，它的生物功能远不止此。解旋酶第二大家族中的RecO解旋酶亚家族在核酸代谢过程中起了关键的作用。在哺乳动物中包含有5个成员：RecqQLI，WRN，BLM，RecQL4和RecQL5，其中WRN，BLM和RecQL4的突变可分别导致3种常染色隐形遗传病：布卢姆综合征，沃纳综合征和RothmundThomsonSyndrome。特别是RecOL4作为RecQ家族一员由于它在临床上的发现它具有双重作用，即不但其功能缺失促进肿瘤高发，而且其异常的高表达也可促进人类肿瘤的进展过程。有研究发现异常高水平的RecOL4蛋白与前列腺肿瘤细胞的致瘤性密切相关。因

5、此做为抗肿瘤药物研发及新的肿瘤治疗战略RecOL4具有重要的临床应用价值。基于此本研究希望利用生物信息学的方法分析RecQL4抗原表位和研制特异性配对单克隆抗体，并初步开展相关检测产品的研发。为进一步开展研究RecQL4表达水平与肿瘤细胞相关性，以及肿瘤对铂类或其它种类化疗药物敏感性研究奠定基础。本项目分别采用生物信息学的方法获得RecQL4的多肽抗原，通过软件预测确定5条抗原表位多肽的氨基酸序列，并进行人工合成。合成的多肽抗原通过质谱鉴定和高效液相纯化，纯度达到抗原合成的要求。并把合成多肽与载体蛋I刍KLII偶联，形成免疫抗原。用该5个抗原免疫Balb／cd、鼠，每条多肽抗原分别获

6、得了一株稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株，编号分别为185、2D6、3C8、4D2、5A7。5株单克隆抗体细胞培养上清抗体Westernblot显示2D6和5A72个抗体与Recql4基因工程表达抗原特异性结合。2株单克隆抗体纯化后的抗体效价分别为1：1．24X105、1：1．24×105，亲和力常数分别为K(2D6)=2．1×lo。L／moL，K(5A7)=6．7×108L／moL。利用2D6和5A7这2株抗体进行胶体金双抗体夹心检测方法初步探讨，在胶体金检测IIl万方数据方法初步建立的过程中，我们对反应体系中的各个环节进行了优化。确定了包被胶体金为2D6，标记浓度为4．8ug／ml

7、，5A7为划膜抗体，划膜浓度为0．6mg／ml。在O．25ng／ml一8ng／ml的检测范围内，线性方程y=1．0356x+0．0039，R20．9924。IV关键词：RecOL4；肿瘤；抗原表位；单克隆抗体；胶体金万方数据Abs仃actTheDNAdoublehelixwasproposedbyWasonandCrick，DNApolymeraseWaSdiscoveredbypeoplefollowed，itformedanewchainfromasi