蓝舌病病毒群特异性构象抗原表位的初步鉴定与竞争elisa检测方法的建立与应用

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1、摘要摘要蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)，属呼肠孤病毒科、环状病毒属、蓝舌病病毒亚群(Bluetonguevirussubgroup)，该病是由库蠓传播的非接触性反刍动物病毒性传染病，纯种细毛羊对该病最为敏感，死亡率高达35％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病，并且要求实时通报疫病，我国已将其规定为一类动物传染病。迄今为止尚未发现BTV对人类有传染性。BTV最早发现于1876年，呈世界性分布。目前己从非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲的多个热带、亚热带和温带地区国家分离到BTV，并且其分布范围不断扩大，危害也目趋严重。我

2、国于1979年发现本病存在，现已从全国29个省检出BTV血清阳性家畜。到目前为止，全世界共分离到26个血清型BTV，我国已鉴定出BTV-1、2、4、9、15、16、23等7个血清型，其中BTV-1和BTV-16是主要的致病血清型。BTV基因组大小约19Kb，由10个分节段的双股RNA组成，编码7种结构蛋白(VPl～VP7)和5种非结构蛋白(NSl，NS2，NS3，NS3a，NS4)。VP7蛋白由S7基因编码，大小为349个氨基酸，位于病毒核衣壳的表面，约占病毒核心蛋白总量的36％。研宄表明，各血清型BTVVP7蛋白94％以上的氨基酸保守，是BTV群特异

3、性抗原蛋白。目前，国际上已经开展了一些针对于蓝舌病病毒VP7蛋白抗原表位鉴定的研究工作，但主要还是针对抗原线性表位的鉴定，对于VP7蛋白构象表位的鉴定工作还没有报道。Grimes等人构建的晶体结构表明，VP7蛋白呈三聚体结构，其中第134-253位氨基酸所构成的晶体结构位于VP7蛋白三聚体结构的外表，是决定VP7蛋白抗原性的主要部位，也是与宿主细胞识别并吸附的主要部位。由于BTV血清型众多，各血清型之间无交叉保护作用。在这种情况下，加强蓝舌病病原学监测工作，使用准确的检测手段对病原进行检测，及时隔离和处理已感动物，是减少经济损失的关键。以具有群特异性阻

4、断效果的单克隆抗体(McAb)为基础的竞争ELISA(C．ELISA)检测待检样品中的BTV抗体，具有特异、敏感、稳定和安全的特点，是OIE指定的血清学检测方法之一，但由于进口免疫学检测试剂盒价格昂贵，无法在畜牧业养殖业中推广应用，所以筛选制备具有BTV群特异性阻断效果的McAb，自主研发C．ELISA检测试剂盒，为我国BT的流行病学调查和监测提供快速、安全及低成本的技术手段工作势在必行。本研究利用BHK．21细胞对血清型12型BTV病毒进行扩繁，提取病毒RNA，通过RT-PCR方法扩增VP7基因，将扩增后的VP7基因经双酶切后连接到原核表达载体pMA

5、L．c4X上，构建出重组质粒pMAL．c4X．VP7。将重组质粒转化到大肠杆菌TBI感受态细胞中，经IPTG诱导表达MBP．VP7融合蛋白后，利用树脂对该蛋白进行纯化，Westernblot和间接ELISA结果表明MBP—VP7蛋白具有良好的BTV群特异性免疫原性，并可诱发机体产生针对于蛋白构象表位的多克隆抗体。利用纯化后的MBP—VP7蛋白为免疫抗原，免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2／0细胞进行融合，以血清型12型BTV粒子作为筛选抗原，建立间接ELISA检测方法，筛选分泌VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，本研究

6、最终获得了5东北农业大学农学博士学位论文株能稳定分泌针对VP7蛋白的McAb的杂交瘤细胞株，并将其分别命名为：BTV-1F3、BTV-2D10、BTV-2H10、BTV-4F11和BTV-4H7，这些抗体的获得为BTV检测方法的建立及抗原表位鉴定提供了物质基础。利用抗体亚类鉴定试剂盒对本研究筛选到的McAb进行鉴定，结果表明，5株McAbs重链均为IgG，，轻链均为K链。间接免疫荧光(IFA)试验表明，单克隆抗体BTV-2D10和BTV-4H7可以与BTV24个血清型发生特异性反应，而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)

7、、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)不反应，说明这两株McAbs均为BTV群特异性单克隆抗体。竞争ELISA试验证明，BTV-4H7具有良好的BTV群特异性阻断效果，所以本研究以MBP．VP7蛋白作为包被抗原、BTV-4H7作为竞争抗体，建立了C．ELISA方法。利用该方法与IDEXX公司生产的BTV诊断试剂盒进行比较，同时检测15种不同血清型的BTV阳性血清及322份采自广西省不同地区的山羊血清样品，两者的符合率分别为loo％干D98

8、％，说明该方法可以用于BT的流行病学调查和监测工作，该方法的建立为我国BTV抗体的监测提供了安