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1、细胞色素P4503A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定作者：刘海英，杨微，武正华，唐晓波，朱大岭【关键词】CYP3A4;,合成肽;，多克隆抗体，［摘要］口的：制备兔抗人细胞色素P4503A4(CYP3A4)抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP3A4多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体。辛酸硫酸鞍法纯化抗体，间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数，Westernblot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分了CYP3A4的抗体。该
2、抗体效价为1：16000;相对亲和力常数在105〜106M-1,具有实用价值；可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP3A4;Westernblot的结果显示，该抗体识别的和应抗原的和对分子质量(Mr)为46000o结论：合成的多肽KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、Westernblot和免疫组化实验。［关键词］CYP3A4;合成肽；多克隆抗体细胞色素3A4(CYP3A4)是细胞色素P450超家族成员之一,主耍存在于肝脏中、小肠中。它是人类药物代谢酶中的最重要的酶,在临床上超过半数的
3、约物完全或部分地被该酶代谢［1］。CYP3A4与外源性致癌物、抗癌药物和内源性类固醇激素、维生素、脂肪酸的代谢转化密切相关［2,3］o目前，国外已研制出抗CYP3A4的抗体并且应用试验中；而国内在研制CYP450抗体领域属于空口阶段，我们研制出针对278-292位的抗人CYP3A4抗体，并将对CYP3A4功能的研究、体外药物代谢及对其基因表达调控的肿瘤防治提供新的思路。1材料和方法1.1材料日本大耳白兔，雄性，6周龄，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺(TMB)均购自Sigma公司oHRP山羊抗兔IgG购自JacksonImmunoResearch公司。
4、牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜(NC)购自BIORAD公司。ECLPlus购自AmershamBiosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。正常人肝脏组织，由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。1.2方法1.2.1CYP3A4抗原表位的分析由SWISSPROT网站获知CYP3A4蛋白的序列，然后利用DNAStar软件分析其序列的特点，确定278-292位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列：SQNSKETESHKALSDo1.2.2CY
5、P3A4多肽的合成及其与KLH和BSA的交联CYP3A4多肽由北京中科亚光生物有限公司合成；获得的多肽经常规C18的RP2HPLC柱进行纯化，纯度达95%oCYP3A4与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法，将5mg合成多肽分别加入7mgKLH和BSA屮，边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液（1mL）,室温作用2ho以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，交联成CYP3A4KLH.CYP3A4BSA偶联物。1.2.3兔抗CYP3A4多肽抗体的制备每只取200卩g多肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射，每点约100Pgo2周后加强免疫，剂量同前，用不完全福氏佐
6、剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射；以后隔2周加强1次；从第3次加强免疫开始，每次免疫后7d,经耳缘静脉釆血测定抗体的效价[4,5]。经4次加强免疫后，符合要求，立即颈动脉取血。分离血清后，无菌分装保存于-80°C备用。1.2.4人肝脏微粒体蛋白制备取10g正常人的肝脏、剪碎,用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋口后，加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4°C以10000g离心30min,取上清液，以30000g离心60min,取上清液及100000g离心60min,取沉淀后，悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200mL/L廿油，5g/L胆酸钠，2mg/L抑肽酶,2mg/L亮肽素，1
7、mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟）中，用Bradford法进行蛋口定量。分装后，置于-80°C冰箱内贮存备用。1.2.5抗血清的纯化用醋酸钠缓冲液（60mmol/L,pH二4.0）将抗血清稀释3〜4倍,0.1mol/LNaOH调节pH至4.5,缓慢滴加辛酸至浓度为25mL/L,室温搅拌30min。4°C10000g离心30min,弃沉淀后滤膜（0.22um）过滤，加入1/10体积的10XPBS,用0.1mol
