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《制备针对tk不同抗原表位的多克隆抗体》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、制备针对TK不同抗原表位的多克隆抗体人组织激肽释放酶(TK)作为人激肽释放酶-缓激肽(KKS)系统中的一个关键酶,能通过裂解低分子量激肽原释放缓激肽和激肽类物质,进而与血管壁和其他部位的内皮平滑肌细胞上的缓激肽受体2(B2)结合,激活一氧化氮-环磷酸腺苷(NO-cAMP)和前列环素-环磷酸腺苷(Prostacyclin-cAMP)等信号通路,触发一系列生物活性效应,包括血管舒张、平滑肌收缩和舒张、抑制凋亡、炎症、增殖、肥大和纤维化,及促进血管生成和神经发生等[1,2].由于B2受体广泛存在于人体内的组织及细胞中,如平滑肌细胞、神经细胞、肾小管上皮细胞和心肌细胞中[3],因此T
2、K具有广泛的生物效应并可能在心脑血管疾病的发生发展中具有广泛的应用前景.本研究利用生物信息学预测TK蛋白可能的高级结构、亲水性和抗原性高低,根据分析结果,选取预测抗原性较高、与已知蛋白同源性低的多肽片段,将其免疫家兔,制备针对TK不同抗原表位的多克隆抗体,为TK检测试剂盒的制备以及进一步研究TK在心脑血管疾病发生发展的作用及机制奠定了基础.1材料与方法.1.1主要材料日本大耳白(2kg)购自华中科技.大学同济医学院实验中心;血蓝蛋白(KLH)、戊二醛、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏完全佐剂(FIA)、TMB购自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、HRP标记羊抗兔Ig
3、G购自武汉凌飞生物有限公司;抗体亲和层析试剂盒购自PIERCE公司;TK-4T1融合蛋白为本实验室生产[4];预染的蛋白质分子量标准购自Fermentas(MBI)公司;PVDF膜购自德国SchleicherSchuell公司;化学发光试剂ECL购自PIERCE公司;凝胶成像系统(GeneGeniusBioIma-gingSystem)为Synegene公司产品;B为底物测定OD450nm值,以(被检标本值-空白对照值)/(阴性对照值-空白对照值)即P/N≥2.1为阳性.采用间接ELISA相加实验进行测定.以TK-4T1融合蛋白为抗原包被酶标板,前两孔分别加入上述两种多
4、抗(抗11P及抗12P),其OD值分别记录为A1和A2,第3孔先以其中一种饱和量的多抗于37℃作用1h,洗涤后再与另一种多抗作用1h.洗涤后,加入HRP标记的羊抗鼠IgG,于37℃保温30min,洗涤后加TMB显色,A450值记录为A1+2,计算相加指数:AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]100%.每组做3个复孔,取其平均值.AI>50%者,即认为这两种多抗识别TK不同的抗原表位.1.6TK多克隆抗体的特异性及纯度检测我们将TK-4T1与纯化后的TK多克隆抗体行r约55kD处形成单一阳性染色带,与TK-4T1蛋白分子量的理论值相符,而阴性对照处则无条带出现,表明获
5、得了抗TK的多克隆抗体(图3).2.4多肽抗体的纯度利用亲和层析法分别纯化了抗11P与抗12P,并采用回收的抗体样本做了SDS-PAGE染色,结果均发现了清晰的两条带(轻链和重链)且未见杂带.因此,该抗体的纯化率为100%(图4).3讨论.人组织激肽释放酶是一类丝氨酸蛋白酶,位于人类染色体19q13.13~19q13.14上,因编码不同的丝氨酸蛋白酶而具有不同的功能.人组织激肽释放酶由15个成员组成.人和动物的组织激肽释放酶中只有一种酶能有效地使激肽原释放生物活性物激肽即为TK[5].我们前期制备TK多抗的方法是采用构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化图4TK多克隆抗体经
6、亲和层析纯化后的SDA-PAGEFig.4SDA-PAGEofaffinitychromatographyforpoly-clonalantibodiesNote:M.Proteinmarker;1.Anti-11P;2.Anti-12P.融合蛋白(TK-4T1),随后免疫动物制备抗血清[4].鉴于利用融合蛋白制备抗体的过程繁琐,费时费力,特异性不理想,不利于我们进一步进行TK相关的临床研究.因此我们利用信息学在基因识别、蛋白质功能预测、蛋白质生理范围的确定、蛋白质高级结构的预测等方面的重要作用来对TK的抗原性、跨膜结构域、二级结构、疏水性、结合位点、氨基酸的带电性、所选择氨
7、基酸偏碱性和偏酸性及多肽的合成难易等进行分析[6].充分评估这些因素后我们选择了针对TK不同表位的两条多肽来制备针对TK不同表位的多克隆抗体.由于合成的多肽纯度均高达98%,并且是针对TK一段表位的,因此其可能具有较高的效价及纯度,并具有较强的特异性.我们的结果证实利用这两条肽段制备的多抗均具有较高的效价及较强的特异性,并且是针对TK不同表位的抗体,经纯化后,这两种抗体的纯度均为100%.这说明我们的多抗制备是非常成功的.此外,由于这两种抗体是针对TK不同表位的,我们可以将这两种抗体应用于TK的双抗体夹
