链霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备.pdf

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1、2010年第3期(总第158期)链霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备张桂贤(临沂师范学院生命科学学院276005)摘要利用直接化学交联法将链霉素(sM)与蛋白~(BSA，oⅥ)偶联生成免疫原和包被原，对偶联产物采用紫外扫描和麦芽酚试验鉴定偶联成功。用免疫原免疫BALB／C小鼠，用间接ELIsA检测抗体效价，采用竞争ELIsA测Ic5O，获得了效价为1：51200，IC50为23．62ng／ml~TC&霉素多克隆抗体，与双氢链霉素的交叉反应率为107％，与同类的其它药物均无交叉反应。关键词链霉素人工抗原合成多克隆抗体制备中图

2、分类号：$859．796文献标识码：A文章编号：1007-1733(2010)03—0009-03链霉素(sM)作为一种重要的氨基糖苷类抗生素，具pH7．4PBS中加入50gl的Tween．20，摇匀即可，4"C冰箱保有性质稳定、抗菌谱广、生产工艺简单、疗效好(尤其是存。封闭液(5％脱脂乳)：称取5g脱脂奶粉溶于100ml具有强大的抗结核杆菌的作用)，因而被广泛的应用于动pH7．4PBS中，4"C冰箱保存。抗体稀释液：pH7．4物疾病的治疗和预防上。但链霉素具有严重的耳毒性和0．01mol／L的PBS，4"C冰箱保存备用。底物

3、缓冲液：枸橼。肾毒性，它在动物性食品中的残留已引起国内外的普遍酸．磷酸缓冲液(枸橼酸0．51g，1．84gNa2HP04．12H20定容关注[1-2J。目前，我国对于食品中链霉素残留的检测主要于100ml纯水中)，4"C冰箱保存。显色液：准确称取采用仪器分析方法，如气相色谱、液相色谱及质谱法OPD(邻苯二胺)5mg，溶于10ml底物缓冲液中，再加入等，这些方法虽灵敏度高，但处理过程复杂，且检测费30％I-12015~tl，混匀即可，现配现用。终止液(10％硫用高，因此不能广泛应用，而免疫学检测法是未来抗生·酸1：量取浓硫酸10

4、ml，逐滴加入到90ml双蒸水中，混素残留检测的首选方法，而应用单克隆抗体建立的ELISA匀，室温保存备用。法可在生产过程中用于大量样本的快速筛选检测【¨1。所1．2方法以本试验研究目的在于制备链霉素的多克隆抗体，为链1．2．1人工抗原的制备制备方法采用直接化学交联霉素残留的免疫学检测奠定基础。法，链霉素可以利用分子中的醛基和蛋白质的氨基直接1材料与方法缩合，反应路线见图l【51：1．1材料1．1．1主要试剂与器材链霉素(Streptomycin，SM)购自Sigma公司；牛血清白蛋~I(BSA)购自中国医药(集团)上海化学试

5、剂公司(批号F030405)；卵清蛋白(OVA)购自SigmaNH29．6碳醚盐蠼冲i覆公司(批号BP0123)HRP标记羊抗鼠IgG购自北京鼎国生物一37℃l2h公司；u．1800型紫外分光光度计由日本日立公司生产；SUNRISE型酶标仪由瑞士TECAN公司生产；96孔可拆式酶标板由浙江省临海市华威分析仪器有限公司生产。1．1．2试验动物SPF级BALB／C纯系小鼠4只，由临沂图1SM与载体蛋白合成路线师范学院实验中心提供。具体合成路线：(1)称取BSA50mg，溶解于6ml的1．1．3主要溶液0H9．6碳酸盐缓冲液：1．7

6、gNa2Co3，pH为9．6的碳酸盐缓冲液中。(2)称取链霉素82．5mg溶2．8gNaHCO3定容于1000ml超纯水中，4"C冰箱保存。解于4ml的pH为9．6的碳酸盐缓冲液中。(3)将上述两种NaOH试液：取NaOH4．3g，加入双蒸水至100ml。硫酸铁胺溶液混合，并于37℃轻微搅拌反应12h。(4)将反应液试液：取硫酸铁胺0．1g，加入0．5mol／L的硫酸溶液至5ml，收集用pH7．20．01mol／L的磷酸缓冲液透析4gh。并收集使之溶解完全。包被缓冲液(pH9．6)：准确称取NaCO312h、24h、48h的透

7、析液。(5)将透析后的反应物小量分0．85g，NaHCO31．4g，双蒸水定容至500mL，4V冰箱保存装．2O℃冻存备用。备用。pH7．40．Olmol／L的PBS：准确称取KH2PO40．2g、将卵清蛋白与链霉素的偶联也采用同样方法，将偶KCL0．1g、Na2HPO4‘12H202．9g、NaC18．0g，加双蒸水溶联物作为包被原，用于间接ELISA法。解，定容至1000m，4"C冰箱保存。洗涤液：每lOOml1．2．2人工抗原的鉴定(1)显色反应。链霉素在碱性溶9山东畜牧兽医2010年第31卷液中，分子发生重排，使环扩大

8、形成六元环，然后消除0．Olmol／1pH7．4的PBS稀释成一系列浓度(10000、1000、N-甲基葡萄糖胺和链霉胍，生成麦芽酚(q．甲基．6．羧基．100、10、1、0．1ng／m1)，分别取10011与浓度为1：100的多^r．吡喃酮)，麦芽酚与硫酸铁铵溶液形成紫红色