头孢氨苄人工抗原的合成及单克隆抗体的制备.pdf

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterSynthesisofArtificalAntigenofCefalexinandPreparationofMonocloneAntibodyforCefalexinByQifaZhaoSupervisor：Prof．AipingWangZoologyDepartmentofBioengineeringMay,2012llrlIIrIlitIrIrlIIjY2102170学位论文原

2、创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：k层纵日期：10如年舌月f日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权

3、郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：匙^墨l仅日期：。Jz年石月J『El摘要头孢氨苄(Cefalexin，CEX)，1967年首次合成，是第一代人工半合成的口服头孢菌素类抗生素药物，它的抗菌谱与头孢噻啶、头孢噻吩等头孢菌素类抗生素药物相似，是广泛应用于临床和兽医临床的抗生素之一。过度滥用此类抗生素药

4、物导致细菌耐药性增强，同时农畜产品中广泛存在的药物残留对过敏人群和其他不适用此药物的人群造成了极大的潜在危害。各地不断发生因头孢氨苄引起严重过敏病例，有多例过敏性休克甚至死亡病例。中华人民共和国农业部组织修订并于2002年12月24日以235号公告发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定CEX在牛的肾脏中的残留限量为1000lag／kg，牛肉中CEX残留限量为200ug／kg。随着科学技术的不断发展和国家政府的重视，头孢氨苄检测方法也不断发展。目前常用的检测方法有近红外漫反射光谱法、高效液相色谱法、紫外分光光度计法、液

5、质联用法、光化学荧光法、荧光分光光度计法、流动注射化学发光法等。这些方法所需要的仪器复杂昂贵，使用这些仪器需要专业人员和专业操作，样品的前处理耗时繁琐，难以达到简便、快速、直观的现场检测要求，而在动物样品的复杂基质中开展痕量残留分析时，灵敏度、特异性、准确性、精密性，以及分析效率和成本是最为重要的考核指标，免疫化学技术特别是酶联免疫分析技术，具有高选择性、高灵敏度和高通量特点，恰好可以满足上述要求，必定会在快速检测CEX残留中发挥不可替代的作用。为了建立一种快速、灵敏的头孢氨苄残留的免疫学分析检测方法，本研究在分析头孢氨

6、苄免疫学特性的基础上，合成头孢氨苄的人工完全抗原，并利用杂交瘤技术制备了抗头孢氨苄单克隆抗体，为动物性食品中头孢氨苄残留免疫学快速检测方法的建立奠定基础。主要研究结果如下：1．头孢氨苄人工完全抗原的制备和鉴定戊二醛法合成头孢氨苄(Cefalexin，CEX)全抗原CEX．BSA、CEX．OVA，采用紫外扫描法(Uv)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法来(SDS．PAGE)鉴定偶联效果；选择CEX．BSA作为免疫原，免疫了三只BALB／c小鼠，采用间接ELISA法检测小鼠多抗血清滴度，间接竞争ELISA法检测小鼠多抗血清的敏感性和特异

7、性。根据Uv扫描结果计算出免疫原CEX．BSA和包被原CEX．OVA中CEX和载体蛋白BSA、OVA的分子偶联的结合比率分别为21．7：l和14．6：1：SDS．PAGE电泳结果表明BSA的迁移率比偶联物CEX．BSA的大，说明偶联物摘要CEX．BSA的分子量大于空白载体BSA，该鉴定结果初步证明了小分子CEX与载体蛋白BSA偶联成功。2舟免疫小鼠多抗血清的效价最高，对CEX的IC50为769．588ng／mL，其与头孢拉定的交叉反应率为1．283％，与其他药物无明显交叉反应现象。实验制备了高效价、敏感、特异的多克隆抗体

8、(pAb)。2．头孢氨苄单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定根据间接ELISA法和间接竞争ELISA法检测结果挑选出细胞融合备用鼠；采用杂交瘤技术制备出抗头孢氨苄的单克隆抗体(CEXmAb)，然后对制备的单抗的效价、敏感性、特异性、亲和力和亚型等免疫学特性进行鉴定；然后用体内诱生腹水法制备出大量抗头孢氨苄的单克隆抗体