基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备

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1、第31卷第5期华中农业大学学报Vo1．31No．52012年1O月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityOct．2012。598～603基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备秦绍钊何月秋李曼雷屈文王光勇。丁元明1．云南农业大学植物保护学院，昆明650201；2．云南出入境检验检疫局技术q-心，昆明650228；3．昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明650224摘要基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)#b壳蛋白抗原表位所在的结构域，明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319~328、384~388、420~430、4

2、80~487、495~511位氨基酸残基附近。通过RT-PCR扩增出了目的片段，构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体，表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性。采用杂交瘤细胞技术，利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体，制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应。检验结果表明，制备的抗血清具较好的特异性，可应用于TRSV的检疫检验。关键词烟草环斑病毒；抗原表位；原核表达；融合蛋白；单克隆抗体中图分类号S41；S432．41文献标识码A文章编号1000—2421(2012)05—0598—06烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus，顺利开展。国内有

3、关TRSV抗血清制备的报道中，TRSV)隶属豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，是线制备的血清为多克隆抗体L1。j或只是原核表达载体虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种。该病毒的构建[1，尚未见TRSV单克隆抗体制备的研究与粒子是球状、等轴、直径约28nm的二十面体，壳粒报道。由于多抗血清的特异性和效价都存在一定的由60个外壳蛋白亚基组成。TRSV的自然寄主范局限，所以无法保障检测结果的准确性。围广，可侵染54科246种植物[1]。TRSV传播途径笔者根据综合预测结果，有针对性地扩增烟草多样，可通过种子传播、嫁接、机械接种、媒介传播。环斑病毒壳蛋白抗原表位基因

4、所在结构域，获取了TRSV分布于世界50多个国家，我国已从荷兰进口其外壳蛋白的外源融合蛋白，并通过杂交瘤细胞技的萝卜种子、美国进口的大豆和塞尔维亚进口的葵术制备特异性强、灵敏度高的TRSV单克隆抗体，花种子等进口货物中截获了烟草花叶病毒，并将其旨在为准确、快速检疫烟草花叶病毒提供科学依据。列人中国进境检疫性有害生物名录l2]。为防止其1材料与方法通过进出口贸易传人我国，需要加大检验检疫力度。近年来，国内关于烟草环斑病毒的研究报道较1．1供试材料多，但主要集中在生物学的研究和检测方法的建立。烟草环斑病毒(TRSV)从来自云南的文殊兰上早期的研究工作多在病毒的复制与转录、病毒粒体

5、分离得到；E．coliDH5a、TOP10菌种；BALB／c小细胞问传播过程和电化学酶联免疫分析等方面l_3]。鼠，SP2／0骨髓瘤细胞等供试细胞均由云南出入境分子检测的研究主要体现在建立各种不同的方法。检验检疫局技术中心提供。杨翠云等_7]建立了RT-PCR和IC-RT-PCR检测克隆载体pMD18一T购自TaKaRa公司；原核方法。易汪雪等_gJ建立了单管实时荧光RT_PCR表达试剂盒pBAD／TOPO~ThioFusionTMExpres—方法。常规的RT-PCR方法检测也有相关的报sionKit购自Invitrogen公司。道[1012]。以上检测方法虽能提高检验检疫

6、工作效1I2生物信息学软件分析率，但是在检测过程中因检测样品较多，需要使用大首先，利用软件ClustalX(1．83)、MEGA5．0量的抗血清，其中大部分是价格昂贵的进口血清，加和BioEdit7．0对TRSV所有分离物核苷酸序列和之进口血清到货时间周期长，故不便于检测工作的氨基酸序列进行多序列比对(multiplesequence收稿Et期：20120416基金项目：国家质检总局科技计划项目(2010IK259)秦绍钊．博士研究生．研究方向：植物病毒学．E-mail：szqin@163．corn—通讯作者：丁元明，硕士，研究员．研究方向：植物病毒病害及检验检疫．E-mai

7、l：dingdym2008@yahoo．corn．cn第5期秦绍钊等：基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备599alignment)分析各自的保守区域。其次，通过蛋白DNA0．5L；T4DNALigase1L；加ddH20至质结构预测结果最可靠的同源模型化的方法，分析终体积；置于4℃过夜。TRSV外壳蛋白有3个主要结构域，显示外壳蛋白用Nco工和EcoRV进行双酶切鉴定。酶切体系模拟结构中暴露在表面的位点。第三，采用不同的(100L)：10×Buffer2OI．，；Nco工2L；EcoRV计算方法和