莱克多巴胺免疫抗原及多克隆抗体制备

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1、莱克多巴胺免疫抗原及多克隆抗体制备摘要：采用碳化二亚胺一N—羟基琥珀酰亚胺(EDC_NHS)法将莱克多巴胺(RAC)与活化的牛血清白蛋白(BSA)偶联，合成了免疫抗原(RAC—BSA)，经聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外吸收法鉴定偶联成功。用合成的免疫抗原免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体，采用所得抗体和辣根过氧化酶标抗原建立莱克多巴胺直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA),标准曲线呈典型S型，具有良好的线性关系。关键词：莱克多巴胺；抗原；抗体；酶联免疫吸附分析法(ELISA)分类号：S859.84文献标识码：A文章编号：0439-8114(2012)24-5736-03莱克多巴胺属于P2—兴奋剂

2、的一种，是一类结构和功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，它可以加快畜禽的生长速度，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率。P2—兴奋剂常见的有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇等。随着我国对盐酸克伦特罗监管力度的加大，盐酸克伦特罗的非法应用得到了有效的控制，莱克多巴胺作为其替代品，非法应用日益猖獗。由于莱克多巴胺在动物组织中残留可能对人体产生很多不利影响，所以我国农业部、卫生部和国家药品监督管理局明文禁止莱克多巴胺用于动物养殖［1一4］。关于莱克多巴胺的检测方法主要有仪器检测和免疫检测两种，免疫检测法主要包括酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫芯片法以及胶体金层析法［5，6］。质量良好的抗原

3、和抗体是免疫检测法的基本和关键条件。该试验从改进合成免疫抗原的条件入手，制备了莱克多巴胺多克隆抗体，为以后更好地开发对莱克多巴胺的免疫检测方法做好了前期探索工作，对保障我国食品安全和医疗安全等具有十分重要的意义。1材料1.1试剂莱克多巴胺（RAC）;自制酶标抗原（HRP—RAC）;琥珀酸酐；弗氏不完全和完全佐剂；吡啶；牛血清白蛋白（BSA）;卵清蛋白（OVA）;甲醇；二氯甲烷；氨水；对乙基一N，N—二甲基丙基碳二亚胺（EDC）;氮一羟基琥珀酰亚胺（NHS）;N，N—二甲基甲酰胺（DMF）；乙二胺（EDA）;磷酸盐缓冲液（0.01mo1/L,pH7.4）o1.2仪器设备酶标仪（DNM—9602

4、型，北京普朗新技术有限公司）；旋转蒸发仪（RE—52A型，上海亚荣生化仪器厂）;薄层层析板（GF2541型，青岛海洋化工厂）；紫外一可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；红外光谱仪（FTS-135型，巩义市英山谷予华仪器厂）；真空冷冻干燥器（美国Bio-Rad公司）；自动双重纯水蒸馏器（上海申胜生物科技有限公司）；离心机（TGL—16型，上海安亭科学仪器厂）;电泳仪（DYY—6C型，北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCE—24EN型，北京六一仪器厂）。2方法2.1牛血清白蛋白（cBSA—NH2）的活化准确称取27mgEDA溶解于20mLPBS中，用HC1调节pH至7.4，制成A液。依次称取1

5、.5gBSA、84mgEDC溶解于20mLPBS中，制成B液。将B液缓慢加入到A液中，室温搅拌反应2h,将反应液转移到半透膜中，4°（2用尸8S透析3d,4〜6h换一次透析液，透析完毕，用真空冷冻干燥机冻干，得到白色絮状固体，一20°C保存，备用。2.2莱克多巴胺免疫抗原的制备与鉴定采用改良的EDC_NHS法［7］合成免疫抗原（RAC—BSA），称取34mg盐酸莱克多巴胺和10mg镜珀酸酐溶解于2mL无水吡p定中，在磁力搅拌器下搅拌反应至完全。反应物经旋转蒸发除去吡啶，用三氯甲烷萃取除去未完全反应的琥珀酸酐，得到纯的莱克多巴胺半琥珀酸酐酯（RAC—HS），真空冷冻干燥后得到干态的RAC—HS

6、。将RAC—HS溶解于1mL10%DMF溶液中，分别加入一定量的EDC和NHS，室温避光振荡活化一段时间，加入3—巯基乙醇淬灭多余的EDC。加入一定量活化的BSA，室温反应一段时间后，加入盐酸羟胺淬灭未反应的NHS，透析纯化得到偶联物。采用紫外全波长扫描法和SDS-PAGE法对免疫抗原的偶联比进行鉴定。2.3莱克多巴胺多克隆抗体的制备与直接竞争ELISA的建立初次免疫用注射器对抽法将弗氏完全佐剂与免疫原按1:1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射0.5mg免疫原，背部皮下多点注射（5〜10点）。两周后进行二免采用弗氏不完全佐剂，剂量、方法同首免。以后每隔两周加强免疫一次，剂量减半。从第三次免疫开

7、始，每次免疫7d后，耳缘静脉采血0.2mL,室温凝固2h后4°C过夜，10000r/min离心15min，分离血清。检测抗血清效价，阴性兔血清作为对照，当抗血清效价基本不变时，不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，7d后进行颈动脉采血。血液在4°C静置过夜，10000r/min离心15min,分离上清液，即抗血清。抗血清采用硫酸铵盐析法初步纯化，初步获得的抗血清再通过ProteinA—Sepharose4B法继续