探索氯霉素和莱克多巴胺人工抗原合成及鉴定研究

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1、广东工业大学硕士学位论文氯霉素和莱克多巴胺人工抗原合成及鉴定研究姓名：程芬申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：张焜20090603摘要氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种广谱高效的抗生素，因其高效价廉，曾作为细菌性疾病的治疗药物广泛应用于人和动物临床及畜牧业生产。但由于其具有严重的毒副作用，长期微量摄入氯霉素将会导致抵抗力下降感染各种疾病。莱克多巴胺(Ractopamine，RCT)是一种c12．肾上腺素受体激动剂。最初在临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。大剂量使用时具有改变动物的营养代谢，降低机体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物

2、增重，提高饲料使用率的作用，因而被不法商人用于做饲料添加剂。RCT在动物体内的蓄积性残留会对食用者的安全构成潜在威胁。研究用于氯霉素和莱克多巴胺的ELISA(EnzymeLinkedIm瑚加os0舭ntAssay)检测试剂盒，对保护消费者利益，食品安全以及国际贸易有重要的意义。本论文开展莱克多巴胺和氯霉素的人工抗原的合成及ELISA检测方法的建立等方面研究，先用莱克多巴胺、氯霉素分别与载体蛋白牛血清蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)合成了免疫抗原，与载体蛋白卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)合成了包被抗原，再经紫外、红外光谱、凝胶电泳

3、实验证明半抗原与载体蛋白是否偶联成功。研究结果表明：氯霉素人工免疫抗原红外光谱图中3425．7cm"1处出现O．H伸缩振动吸收峰，1641．2cm"1和1376．5cm"1出现了C=O和C-N特征吸收峰，说明生成了酰胺；1000-1200cml出现的宽且强的酚的C．O伸缩振动吸收峰，而BSA的IR中并无此吸收峰，表明合成的人工抗原红外光谱图中具有蛋白质和CAP的特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中保留了氯霉素在226nm处的特征吸收峰，在276nm处也出现了特征吸收峰，说明人工抗原紫外光谱图中呈现CAP和牛血清蛋白的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的CAP人

4、工免疫抗原上偶联了30个CAP小分子，合成的CAP人工包被抗原上偶联了37个CAP小分子。莱克多巴胺人工免疫抗原红外光谱图中呈现了蛋白质类共有的吸收，如3306cml的胺基N．H吸收峰、’1653crn"1的酰胺谱带和1536cm"1的酰胺谱带。RCT人工抗原在1000-1300cm"1出现了RCT与BSA偶联后的C．N伸缩振动吸广东工业大学硕士学位论文收峰，而BSA的中并无此吸收峰，说明人工抗原红外光谱图中呈现RCT和牛血清蛋白的红外特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中BSA-RCT最大吸收峰特征波长为276nm，RCT、BSA的特征波长分别为274nm和27

5、8rim，说明人工抗原紫外光谱图中具有蛋白质和RCT的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的RCT人工免疫抗原上偶联了24个RCT小分子，合成的RCT人工包被抗原上偶联了30个RCT小分子。用氯霉素人工抗原免疫母鸡制备抗氯霉素多克隆抗体，根据棋盘滴定抗体效价为64000，抗体的最适工作浓度为1：1500，抗原最佳包被浓度为5肛g／mL，确定最佳包被条件为37"C下温育l小时，然后4。C下包被12小时，用间接竞争ELISA法检测一系列浓度的CAP溶液，发现有20％的抑制率，证明氯霉素人工抗原合成成功。通过免疫Balb／C小鼠制备了莱克多巴胺多克隆抗体，抗体效价

6、为192000，抗体最适工作浓度为1：6000，最佳包被浓度为lgg／mL，通过优化实验，确定最佳包被条件为37℃下温育1小时，然后4。C下包被12小时。间接竞争ELISA法测定莱克多巴胺结果表明莱克多巴胺浓度在102～1×105“g／L范围之间曲线呈良好的线性关系，线性回归直线方程为y--0．2538x-0．3331，相关系数r=0．9787。莱克多巴胺的检测范围为126"--29141“g／L，抑制率为50％时对应的莱克多巴胺浓度为1905pg／L。关键词：氯霉素；莱克多巴胺；人工抗原；酶联免疫分析；鉴定ⅡABSTRACTABSTRACTChloramp

7、henicol(cAp)WaSabroad-spectrumantibiotictoGram-positiveandnegativebacterial．Duetoitshighefficiencyandlowcost,CAPWaSonceusedwidelyinhumanandanimal，andanimalproduction．However,thestrongtoxicityandchromeside—effectsofCAP，long—termingestioncouldinducepeopleinfectwithvariousdiseases．Rac

8、topamine(RCT)WaSoneofthe13