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1、第28卷第3期华中农业大学学报Vol.28No.32009年6月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJune2009,334~338*氯霉素人工抗原的合成与鉴定**方伟胡鲲姜有声黄宣运杨先乐(上海海洋大学国家水生动植物病原库/上海海洋大学水产品药物残留监控检测中心/上海市海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306)摘要采用重氮化法和碳二亚胺(EDC)法合成了氯霉素人工抗原。经紫外光谱法、电泳鉴定表明偶联成功;采用三硝基苯磺酸法测得载体蛋白E-NH+3残基利用率分别为31.02%、22.27%,偶
2、联物的结合比为18.9、-613.6;制备的抗原分别免疫小白鼠获得多克隆抗体,血清效价可达10以上。经比较,碳二亚胺法更适于氯霉素人工抗原的制备。关键词氯霉素;人工抗原;合成;鉴定+中图法分类号S852.43文献标识码A文章编号1000-2421(2009)03-0334-05氯霉素(chloramphenicol,CAP)在动物性产品旨在为下一步的制备高效、特异性强的氯霉素单克中的残留可引起人类再生障碍性贫血,对人类的隆抗体奠定基础。[1]健康造成潜在的威胁。目前世界上很多国家和1材料与方法地区禁止将氯霉素用于动物生产。我国将CAP列入禁用兽药,规定CAP在动物性
3、食品中不得检1.1试剂和仪器[2]出。氯霉素(CAP),纯度99%,氯霉素琥珀酸酯采用免疫学方法作为水产品中药残检测的初筛(CAP-HS),三硝基苯磺酸(TNBS),sigma产品;牛[1,3]方法,具有灵敏、快速和简便等优点,适于大量血清白蛋白(BSA),卵清蛋白(OVA),上海华美生样品的筛查。免疫方法检测的核心是制备灵敏、特物公司产品;弗氏佐剂(FCA、FIA),北京鼎国公司异的抗体。CAP属小分子半抗原,只有反应原性无产品。其他试剂均为国产化学纯试剂。免疫原性,必须与大分子蛋白偶联后才能免疫动物。试验动物:Babl/c小白鼠,雌性,4~5周龄,购目前制备氯
4、霉素人工抗原常采用混合酸酐法、重氮自第二军医大学动物实验中心。化法。前者操作步骤复杂,影响因素较多;后者获得1.2氯霉素人工抗原的制备及鉴定[6]的抗原连接臂太短,造成免疫效果不佳,并且抗原呈1)重氮化法制备人工抗原。取CAP50mg[4-5]红棕色,不利于结合比的测定。通过半抗原的改溶于3mL的HCl中,加入100mg锌粉,室温反应造制备人工抗原,用于评价抗体的特异性、亲和力,30min,上清液(保持pH=1)冷却至0~4e(冰已经用于免疫学的研究。抗原结合比的精确测定对浴),逐滴加入2%的NaNO2溶液0.5mL,搅拌反应免疫剂量的确定和半抗原免疫应答的研究非常
5、重至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止。称取50mg[6-7]要。的牛血清白蛋白(BSA)溶于2mL0.1mol/L的本文建立了采用重氮化法和碳二亚胺法合成pH7.4的磷酸缓冲液中,4e预冷10min,于4e磁CAP人工抗原的方法,在紫外光谱鉴定偶联物的基力搅拌下缓慢加入上述溶液,用1mol/L的NaOH础上,通过氨基酸利用率的分析从本质上揭示并证调pH约为9,继续反应8h。反应物用0.01mol/L实偶联反应的过程,对偶联效率和结合比进行分析,的PBS透析3d,每8h换透析液1次,得到的偶联收稿日期:2008-06-10;修回日期:2009-01-08*/十一五0国家
6、科技支撑计划项目(2006BAD03B04)、上海市科技兴农重点攻关项目(6660106477)和上海市重点学科建设项目(Y1101)资助**通讯作者.E-mail:xlyang@shou.edu.cn方伟,男,1982年生,上海海洋大学水产与生命学院硕士研究生,上海201306.E-mail:fangwei820430@yahoo.com.cn第3期方伟等:氯霉素人工抗原的合成与鉴定335物溶液冷冻干燥后-20e保存备用。备用。同法制备包被抗原CAP-OVA,步骤同上,将载采用间接ELISA法进行血清效价测定,步骤体蛋白BSA换为卵血清白蛋白(OVA)。参考文献[
7、10],包被抗原采用CAP-OVA,抗原抗[4]2)碳二亚胺法制备人工抗原。称取10mg体最适工作浓度参照间接ELISA法和方阵滴定法BSA溶于1mLPBS(0.01mol/L,pH7.4)缓冲液进行。中(Ñ),25mgEDC溶于1mLPBS中(Ò),10mg2结果与分析的氯霉素琥珀酸钠溶于1mLPBS中(Ó),将Ñ液和Ó液混合后加入Ò液,4e搅拌12h,用0.012.1紫外光谱法mol/L的PBS透析3d。通过紫外图谱1、2可以得出,偶联物BSA-CAP同法制备包被抗原CAP-HS-OVA,步骤同上,和BSA-CAP-HS在最大吸收峰处均出现叠加现象,仅将蛋白
