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1、四环素人工抗原的合成与鉴定肖理文,袁耀萍,郗日沫,孙秀兰,王洪新【摘要】 目的:对牛血清白蛋白进行羧基化和四环素的衍生化,制备更高偶联比的四环素（TC）-牛血清白蛋白（BSA）偶联物并进行鉴定。方法:四环素通过两步衍生化后,形成一种活泼的重氮化中间产物,与羧基化的BSA上的表位羧基反应,合成TC-BSA偶联物。结果:HPLC-MASS图谱鉴定表明成功的制备了四环素衍生物,红外及紫外扫描图谱表明,偶联成功,计算得偶联比分别为7∶1和11∶1。结论:BSA经过羧基化后的偶联效果明显好于未经羧基化的BSA,并成功制备了TC-BSA人工抗原。【关键词】四
2、环素（TC）羧基化偶联人工抗原 四环素类抗生素（TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抵抗能力。因其高效、便宜且能直接通过口服起效的特性,被广泛应运于禽畜养殖业中,既能预防治疗疾病,也能起促进生长的作用。1998年,欧洲动物卫生联盟的一份调查显示,在欧盟15国中,四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的65％〔1〕。在国内,四环素类抗生素也同样被大量广泛的用于禽畜养殖业中。人长期低剂量的摄入四环素类抗生素可能会产生各种慢性和蓄积性疾病,主要表现在对胃、肠、肝脏的损害,以及牙齿的染色,还会造成过
3、敏反应、二重感染、致畸胎等,同时可能会导致人体肠道中菌群平衡的失调以及耐药性细菌的产生。为此,我国规定畜禽肉中四环素的最大残留量不得超过100ppb,禽蛋中不超过200ppb〔2〕。目前,我国用于检测四环素类抗生素的ELISA试剂盒主要靠国外进口,价格昂贵,因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器,而其关键之一就是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。我们通过对载体蛋白BSA进行羧基化,大大提高了其表面活性羧基的数量,同时对四环素进行衍生化,获得活泼的重氮化中间产物,再与BSA及sBSA偶联,制备四环素完全抗原并对其进行比较。 1材料和方
4、法 1.1材料UV-2100紫外扫描仪为北京瑞利公司产品;NicoletNexus傅立叶变换红外光谱仪为美国热电公司产品;D4000型高效液相色谱质谱联用仪为美国ASS鉴定〔6〕。(2)四环素衍生物4-腙-脱甲基-四环素（C20H19O8N3）(TC2)的合成:取220mg上步反应所得的TC1溶于15mL950mL/L的乙醇中,室温下缓慢加入50μL水合肼,立刻析出沉淀,磁力搅拌1h。过滤得粗产物,加入8mL乙醇洗涤,反复3次,收集产物,取少量进行HPLC-MASS鉴定〔7〕。 1.2.3TC-BSA和TC-sBSA完全抗原的合成与鉴定取2份经
5、过纯化后的TC2各50mg溶于20mLpH4.7的超纯水盐酸溶液中,分别加入250mgBSA和sBSA,摇匀后缓慢加入20mgEDC,磁力搅拌1h,反应结束后〔8〕,以PBS缓冲液为洗脱液,4℃下SephadexG-25柱凝胶过滤,合并278nm处的收集液,最后冷冻干燥,所得粉末保存于-20℃冰箱中备用〔9〕。 对所合成的完全抗原进行紫外分光光度计扫描测定〔10〕,按下式计算偶联物的结合比〔11〕。 CaCb=ACam·KBbm-ACbm·KBamACbm·KAam-ACam·KAbm 式中:Ca/Cb:偶联物中A、B2种物质摩尔浓度比(
6、结合比);ACam,ACbm:偶联物分别在A、B最大吸收波长下的吸光值;KAam,KBbm:A、B在各自最大吸收波长下的摩尔消光系数;KAbm:A在B最大吸收峰波长处的摩尔消光系数;KBam:B在A最大吸收峰波长处的摩尔消光系数〔12〕。 2结果 2.1四环素衍生物TC1（C20H17O9N）和TC2（C20H19O8N3）的HPLC-MASS鉴定图1和图2是TC1的HPLC-MASS谱图,TC1在液相色谱上的保留时间为5.23min,其余为杂质峰,通过积分计算其纯度为83.35%;质谱图中454和438分别TC1与K+和Na+的离子峰,计算出
7、相对分子质量（Mr）为415,与实际Mr相符,说明TC1合成成功。图3和图4为TC2HPLC-MASS谱图,TC2的保留时间为9.49min,积分得其纯度为52.46%,杂质较多,在与载体蛋白偶联前需通过进一步纯化;质谱图中428.1为其阴离子峰,计算得其Mr为429,与实际Mr相符,由此判断,四环素衍生化合成成功。 图1TC1HPLC图（略） 图2TC1质谱图（略） 2.2TC-BSA和TC-sBSA的HPLC分析取透析后TC-BSA和TC-sBSA做HPLC分析,得到图5和图6的色谱分析图。图中最高峰的出峰时间分别为8.960min和8.
8、925min,与BSA的出峰时间类似,为TC-BSA和TC-sBSA偶联物的吸收峰。但图5中左边有2个比较突出的吸收峰,可
