资源描述：
《四环素人工抗原的合成与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、四环素人工抗原的合成与鉴定作者：肖理文,袁耀萍,郗日沫,孙秀兰,王洪新【摘要】 目的:对牛血清白蛋白进行羧基化和四环素的衍生化,制备更高偶联比的四环素（TC）-牛血清白蛋白（BSA）偶联物并进行鉴定。方法:四环素通过两步衍生化后,形成一种活泼的重氮化中间产物,与羧基化的BSA上的表位羧基反应,合成TC-BSA偶联物。结果:HPLC-MASS图谱鉴定表明成功的制备了四环素衍生物,红外及紫外扫描图谱表明,偶联成功,计算得偶联比分别为7∶1和11∶1。结论:BSA经过羧基化后的偶联效果明显好于未经羧基化的BSA
2、,并成功制备了TC-BSA人工抗原。【关键词】四环素（TC）羧基化偶联人工抗原 四环素类抗生素（TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抵抗能力。因其高效、便宜且能直接通过口服起效的特性,被广泛应运于禽畜养殖业中,既能预防治疗疾病,也能起促进生长的作用。1998年,欧洲动物卫生联盟的一份调查显示,在欧盟15国中,四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的65％［1］。在国内,四环素类抗生素也同样被大量广泛的用于禽畜养殖业中。人长期低剂量的摄入四环素类抗生素
3、可能会产生各种慢性和蓄积性疾病,主要表现在对胃、肠、10肝脏的损害,以及牙齿的染色,还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎等,同时可能会导致人体肠道中菌群平衡的失调以及耐药性细菌的产生。为此,我国规定畜禽肉中四环素的最大残留量不得超过100ppb,禽蛋中不超过200ppb［2］。目前,我国用于检测四环素类抗生素的ELISA试剂盒主要靠国外进口,价格昂贵,因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器,而其关键之一就是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。我们通过对载体蛋白BSA进行羧基化,大大提高了其表面活性
4、羧基的数量,同时对四环素进行衍生化,获得活泼的重氮化中间产物,再与BSA及sBSA偶联,制备四环素完全抗原并对其进行比较。 1材料和方法 1.1材料UV-2100紫外扫描仪为北京瑞利公司产品;NicoletNexus傅立叶变换红外光谱仪为美国热电公司产品;WATERSPlatformZMD4000型高效液相色谱质谱联用仪为美国WATERS公司产品;950mL/L盐酸四环素标准品(TC.HCl)购于中国药品生物制品检定所;牛血清白蛋白（BSA）为北京博奥生物技术有限公司Sigma公司进口分装;丁二酸酐（S
5、uccinicanhydride）、N-氯丁二酰亚胺(NCS)、水合肼（Hydrazinehydrate）均为美国Sigma公司产品;其他试剂均为分析纯;PBS缓冲液为0.01mol/L,pH7.4,所用水均为SZ-97自动三重纯水蒸馏器制得。10 1.2方法 1.2.1BSA的羧基化(sBSA)取20mL0.1mol/L的NaCl溶液,用0.1mol/L的NaOH溶液调pH值至8.0,冷却至4℃,加入1gBSA充分溶解后,缓慢加入75mg丁二酸酐,用3.5mol/L的NaOH调pH值至8.0,保持4℃
6、磁力搅拌1h,随后于PBS缓冲液中透析3d,及时换液,最后冷冻干燥得粉末状固体,于-20℃下保存备用［3,4］。 1.2.2TC半抗原的衍生化与鉴定TC在酸碱条件下都比较活泼,容易形成差向异构化四环素或降解［5］,因此通过两步衍生化,封闭其活性基团,形成一种活泼的重氮化中间产物,再与BSA偶联。(1)四环素衍生物4-氧代脱-甲氨基四环素4,6-半缩酮（C20H17O9N）（TC1）的合成:称取400mgTC.HCl标准品,溶解于20mL超纯水中,滴加适量0.01mol/L的盐酸溶液,使盐酸四环素充分溶解。
7、室温条件下,加入280mgNCS粉末,磁力搅拌数分钟后有沉淀析出。反应30min后,过滤,得粗产物,加入5mL超纯水洗涤,然后加入10mL乙醚萃取,放掉下层水相,反复操作3次,以有效去除杂质。最后将萃取液置于通风厨中,自然挥发收集产物,取少量进行HPLC-MASS鉴定［6］。(2)四环素衍生物4-腙-脱甲基-四环素（C20H19O8N3）(TC2)的合成:取220mg上步反应所得的TC1溶于15mL950mL/L的乙醇中,室温下缓慢加入50μL水合肼,立刻析出沉淀,磁力搅拌1h。过滤得粗产物,10加入8mL
8、乙醇洗涤,反复3次,收集产物,取少量进行HPLC-MASS鉴定［7］。 1.2.3TC-BSA和TC-sBSA完全抗原的合成与鉴定取2份经过纯化后的TC2各50mg溶于20mLpH4.7的超纯水盐酸溶液中,分别加入250mgBSA和sBSA,摇匀后缓慢加入20mgEDC,磁力搅拌1h,反应结束后［8］,以PBS缓冲液为洗脱液,4℃下SephadexG-25柱凝胶过滤,合并278nm处的收集液,最后冷冻干燥,所得
