兽药人工抗原的合成方法

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1、兽药人工抗原的合成方法 1　兽药人工抗原的合成方法　　兽药人工抗原合成的基本方法为兽药半抗原与载体蛋白质的偶联。　　1.1　半抗原的合成　大多数的兽药小分子不具有直接与载体蛋白质交联的功能团（羧基和氨基），需要通过化学合成或衍生的方法首先制备出具有活性交联功能团的相应半抗原。理想的半抗原（合成或衍生后的半抗原）应具有待测物（待测的半抗原原型）的特征结构，且与载体连接后应保持该特征结构能在最大程度为免疫细胞识别和结合（能将该基团暴露）。兽药半抗原活性基团种类主要有-NH2、-COOH、-OH、-SH，在与载体偶联制备人工抗原时，有

2、些活性基团还需要先进行选择性保护和去保护，如阿维菌素半抗原的合成(李俊锁等，1999)。不同的兽药有不同的半抗原活化方法，目前获得半抗原常用的方法有：对药物分子进行改造使之产生活性基团；在药物分子内部引入活泼卤元素，达到所需反应的目的；利用原形药物的代谢产物作为活泼半抗原；利用化学合成的方法合成有活性功能团的半抗原；直接购买与半抗原结构相似的有活性基团的商品化学试剂。　　1.2　兽药人工抗原合成常用的载体　常用于兽药人工抗原合成的载体蛋白质包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)

3、，其中又以牛血清蛋白最为常用。因为BSA理化稳定，经济易得，分子内自由氨基多，与半抗原偶联率高，并且具有在不同pH值和离于强度下以及在含有某些有机溶剂状态下都能保持较大的溶解度。近年来，国内外都有文献介绍以人工合成的多聚肽做载体(常用多聚L赖较氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比BSA更多的自由氨基(与BSA相当分子量的多聚赖氨酸的自由氨基数约是BSA所含数目的10倍)，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联率。以多聚赖氨酸做载体来制备兽药人工抗原尚未见报道，这应该是一个值得探

4、讨的方向。　　1.3　兽药抗原的偶联方法　活化的半抗原与载体偶联应根据半抗原功能团的不同，选用不同的偶联剂和不同的偶联方法。人工抗原合成的传统方法有：混合酸酐法、活泼酯法及碳二亚胺法，用于羧基半抗原与载体的偶联；戊二醛法或重氮化法用于氨基半抗原与载体的偶联；氨基氧乙酸化用于酮基半抗原与载体的偶联；丁二酸酐衍生化用于羟基半抗原与载体的偶联。人工抗原合成的基因工程方法：利用基因工程技术表达特定抗原蛋白或通过核苷酸序列推导合成相应编码的蛋白质抗原肽段，得到目的抗原。　　2　影响兽药人工抗原质量的因素　　人工抗原的质量好坏指其免疫原性的

5、优劣，受多种因素的影响。不同药物的质量影响因素也不尽相同，一方面取决于人工抗原本身的性质，另一方面取决于接受该抗原刺激的机体的反应性。概括起来主要有以下几个方面。　　2.1　抗原分子特性　免疫学理论认为抗原物质除了要求具有一定的分子质量(10ku)外，其表面还必须有一定的化学组成和结构，分子结构和空间结构越复杂、支链越多，免疫原性越强，越易于诱导机体产生抗体。对于具有多个载体偶联位点的兽药半抗原，以不同位点相偶联制备的抗原，其相应的特异性、亲和性、效价也都不相同，即由于不同偶联位点制备的抗原的空间结构不同所致。所以，当一个兽药分

6、子内部有多个不同的结合位点时，要尽可能多合成不同的人工抗原，然后通过比较筛选出最好的抗原用于抗体制备。　　其次，半抗原与载体蛋白的偶联比、间隔臂的长度、偶联方法等也是影响人工抗原免疫原性的重要因素。　　过去人们认为载体表面半抗原的密度越大，越有利于提高人工抗原的免疫原性，但相关的研究报道并非如此，这可能由于过多的半抗原影响了载体蛋白质与淋巴细胞表面的接触致使免疫反应减弱所致。不同兽药人工抗原具有不同的最佳偶联比，一般来说当偶联比为3-45∶1时免疫原性较强，也有研究者认为最佳偶联比为10-20∶1。为了取得最佳免疫效果，不同的兽

7、药应逐个确定与各种载体的最佳偶联比。　　抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应受体接触的难易程度影响着抗原的免疫原性的强弱。由于要求免疫系统对兽药半抗原-载体结合物中载体远端的半抗原识别性强，故间隔臂应选择在远离待测物结构的部分和官能团，且应具有一定的长度，以利于诱导高选择性和高亲和性的抗体。间隔臂的长度和结构对抗体的特异性、效价可造成很大的干扰，太短，载体的空间位阻影响免疫系统的识别；过长，则可能由于间隔臂间的氢键或水交互作用而发生半抗原的“重叠”而影响免疫原性。再者，如果间隔臂的结构过于复杂，制备的抗体则可能对间隔臂的亲和

8、力强而对待测物小分子的特异性弱。可以采取两种方法来减少间隔臂造成的不足，一是在半抗原的相同结合位点结合载体蛋白，但免疫原和包被原应使用不同的间隔臂；二是使用相同的间隔臂而选择不同的结合位点。目前酶免疫分析中多支持间隔臂为3～6个碳原子直链结构最有利于保护抗原决定