clusterin抗原的表达、 抗体制备及其初步鉴定

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1、Clusterin抗原的表达、抗体制备及其初步鉴定：张迎春,刘莹,杨金菊,柳晓兰,迟俊,高建恩,唐晓波,朱大岭,孙启鸿【摘要】　　目的:制备Clusterin（CLU）多克隆和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU。GSTCLU融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb。采用ELISA法和r)约54000处呈现明显表达条带。r约52000和58000的CLU蛋白。获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU蛋白,其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白

2、,4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白。结论:成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb,为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础。【关键词】Clusterin原核表达多克隆抗体单克隆抗体　　[Abstract]AIM:Topreparerabbitpolyclonalantibodies(pAb)andmousemonoclonalantibodies(mAbs)againsthumanclusterin(CLU)andcharacterizetheseantibodies’properties.METHODS:CLUfragmentplifiedfromhuman

3、livercDNAlibrary,andrebinantexpressionvectorspGEX4T1CLUandPET32aCLUmunogen.PropertiesofantiserumagainsthumanCLUAbsagainsthumanCLUmunofluorescentstainingandimmunohistochemistrystaining.RESULTS:TheGSTCLUfusionproteinolecularanlivertotalprotein.AllofthenineestablishedmAbsrecognizedrebinanthumanC

4、LUprotein,tofHepG2cellsandfourofofadultlivertissue.CONCLUSION:pAbandmAbsagainsthumanCLUantumors.　　[Keyonoclonalantibody　　　　Clusterin（CLU）是一种普遍存在的异源二聚体硫酸化糖蛋白,其基因定位于人类染色体8p21,含449个氨基酸,相对分子质量（Mr）为75000～80000。它主要存在于细胞质中并被分泌到细胞内环境,由于CLUmRNA不同的剪切翻译,形成sClusterin（sCLU）和nClusterin（nCLU)2种变体,分别发挥抗凋亡和促进凋亡的作用[

5、1,2],因其功能多样化,又名为TRPM2,SGP2,XIP8,ApoJ(apolipoproteinJ),SP4040。在生理条件下,主要参与脂质转运、组织重建、细胞与基质间相互作用及细胞凋亡等生物学过程[3]。在病理条件下,近年来众多的研究结果表明,CLU在肾细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要的癌基因作用[1,4]。并且它的表达还受与肿瘤生长相关的多种细胞因子的调控,如1,25二羟维生素D3、转化生长因子β1、电离辐射等。但是目前,CLU基因在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手,获得其融合表达蛋白后,免疫

6、家兔和BALB/c小鼠,制备抗CLU抗血清和CLU的mAb,并进行特性鉴定,为进一步研究CLU的功能及其在肿瘤的发生、发展及治疗中的作用奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料成人肝cDNA表达文库购自Cloeck公司。大肠杆菌BL21感受态菌株,pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶BamHI和XholI,ExTaq酶、T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒,质粒提取试剂盒购自OmegaBiotek公司。BALB/c小鼠和2.0～2.5kg雄性大耳白兔子购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所

7、免疫室。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCultbiotechnologyb.v.公司。鼠抗GST标签mAb,HRP羊抗鼠IgG,HRP羊抗兔IgG,FITC羊抗鼠IgG,ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。PolyHelper购自北京吉比埃生物技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1CLU抗原的制备和纯化根据HumanProteinReferenceDatabase中提供的CLU的氨