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1、细胞色素P4503A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定论文.freela公司。HRP山羊抗兔IgG购自JacksonImmunoResearch公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECLPlus购自AmershamBiosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。正常人肝脏组织,由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提
2、供。1.2方法1.2.1CYP3A4抗原表位的分析由SB显色,37℃孵育15min,终止反应后,用酶标仪式测定样品A450值.1.2.7间接ELISA检测抗血清亲和常数ELISA检测板分别用多肽交联BSA包被成5mg/L和10mg/L,封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的多抗,再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗,TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标,A值为纵坐标作图。以曲线达到水平的A值为100%,求出A50即50%A值时对应的抗体浓度.按照Kaff=(n－1)/2(nAb’t－
3、2Abt)算出抗体亲和常数,其中Ab’t、Abt指的是A50时即包被分别5mg/L和10mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度,Agt,Ag’t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10μg和5μg,n=Agt/Ag’t,本实验中n=26。1.2.8多克隆抗体的-1。③抗体特异性鉴定:以制备的人肝脏微粒体蛋白、多肽BSA、BSA作为抗原,以兔抗血清作为一抗进行r约为46000处出现1条清晰带,与CYP3A4Mr相符;与多肽BSA在Mr约为69000处出现1条清晰带,与BSAMr相符;而与BSA则无条带出现
4、（图3）。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP3A4蛋白结合。图2－图3略2.4兔抗人CYP3A4多克隆抗体的免疫组化定位CYP3A4主要分布在内质网和线粒体内膜,而二者位于胞质中。经免疫组化实验证明,CYP3A4多肽多克隆抗体可与正常人肝细胞胞质中的CYP3A4蛋白结合（图4）。图4兔抗人CYP3A4多克隆抗体的免疫组化定位分析略3讨论国外Abcam、Researchd、Cypex公司已研制出用于ELISA、r是46000,另一条大约是90000。我们认为90000的
5、条带可能是CYP3A4的二聚体。抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。多克隆血清是含有不同亲和力抗体的复杂混合物,因此,多克隆血清的亲和力不能精确测定下来,但可制定其平均相对亲和力11。根据文献,本实验中相对亲和力在105～106M-1,对确定抗体的用途和验证抗体的均一性等均有重要价值。总之,我们以合成肽KLH为抗原免疫家兔制备了抗CYP3A4pAb,DA27/IL224多克隆抗体的制备和特异性鉴定J.细胞与分子免疫学杂志,2006,22(3):380-381.6BeattyJD,Beatty
6、BG,easurementofmonoclonalantibodyaffinitybynonpetitiveenzymeimmunoassayJ.ImmunolMethods,1987,100(1-2):173-179.7高媛,杨金菊,柳晓兰,等.兔抗人CXCR32B分子N端多肽多克隆抗体的制备与初步应用J.细胞与分子免疫学杂志,2006,22（2）:223-226.8陈兴,王更银,丛爱丽,等.人DAO氨基酸序列片段B2细胞表位的多参数预测J.免疫学杂志,2000,16(5):232-234.9江
7、平,侯艳宁,陈兴.大鼠P450侧链裂解酶抗原决定簇多参数预测及合成J.免疫学杂志,2005,21（6）:489-492.10孙瑛勋,栾晓,孙启鸿,等.合成多肽为半抗原制备抗SCF受体单克抗体J.细胞与分子免疫学杂志,1998,14(2):126-129.11哈洛E,莱恩D（沈关心,等译）.抗体技术实验指南M.北京:科学出版社,2002:21-23.
