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《兔抗人细胞色素p450 4a11合成肽抗体的制备与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、兔抗人细胞色素P4504A11合成肽抗体的制备与鉴定：杨微,刘海英,武正华,唐晓波,朱大岭【关键词】CYP4A11;,合成肽;,多克隆抗体 [摘要]目的:制备兔抗人细胞色素P4504A11（CYP4A11）抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:利用生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列,根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、合成CYP4A11多肽,与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联,免疫大耳白兔制备抗CYP4A11抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体,对纯化的抗体进行ELISA、r）为53000,可识别正常
2、肝脏的CYP4A11。结论:合成的多肽KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、B）均购自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购自JacksonImmunoResearch公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECLPlus购自AmershamBiosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、BSA的联接由北京中科亚光生物科技有限公
3、司完成。正常人肝脏组织,由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。 1.2方法 1.2.1CYP4A11合成肽的设计利用DNAStar软件根据抗原指数(AntigenicIndex)、亲水性结构（HydrophilicityPlot）、柔韧区(FlexibleRegions)及表面概率结构(SurfaceProbabilityPlot)4个参数综合分析CYP4A11序列的特点,确定505～519位15个氨基酸为欲合成的肽序列:RLRRLPNPCEDKDQL。 1.2.2CYP4A11肽的合成及其与KLH和BSA的交联CYP4A
4、11合成肽由北京中科亚光生物科技有限公司采用合成肽自动合成仪合成;获得的合成肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化,纯度为96.9%。CYP4A11与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法,将5mg合成肽分别加入7mgKLH和BSA中,边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液（1mL）,室温作用2h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜,交联形成CYP4A11KLH、CYP4A11BSA偶联物。 1.2.3兔抗CYP4A11合成肽抗体的制备取200μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮下多点注射,每点约1
5、00μg。2周后加强免疫,剂量同前,用不完全福氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮下多点注射;以后隔2周加强免疫1次;从第3次加强免疫开始,每次免疫后7d,经耳中央动脉采血测定抗体的效价,经过4次加强免疫后符合要求时,立即颈动脉采血,分离血清后,无菌分装保存于-80℃备用。 1.2.4人肝脏微粒体蛋白制备取正常人的肝脏、剪碎,用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后,加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。采用差速离心（4℃,10000g离心30min,取上清液30000g离心60min,取上清100000g离心60min）,沉淀悬浮于磷酸钾盐
6、缓冲液（含有200mL/L甘油,5g/L胆酸钠,2mg/L抑肽酶,2mg/L亮肽素,1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟）中,用Bradford法进行蛋白定量后,置-80℃保存备用。 1.2.5辛酸硫酸铵法纯化合成肽抗体用醋酸钠缓冲液（60mmol/L,pH4.0）将抗血清稀释3～4倍,0.1mol/LNaOH调节pH至4.5,缓慢滴加辛酸至浓度为25mL/L,室温搅拌30min。4℃10000g离心30min,弃沉淀后滤膜（0.22μm）过滤,加入1/10体积的10×PBS,用0.1mol/LNaOH调节pH至7.4
7、,缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45%饱和度,混合后4℃过夜。4℃3000g离心30min,弃上清后,用0.01mol/LPBS（pH7.4）重悬,透析过夜。用Branford法进行蛋白定量。经SDSPAGE分离后,用BIORADquantityone软件分析其纯度。 1.2.6ELISA检测抗血清效价分别用人肝微粒体蛋白和合成肽BSA偶联物以1mg/L的浓度包被ELISA检测板,每孔100μL,4℃孵育过夜后,用10mL/L小牛血清封闭,37℃2h后,洗涤备用。取出包被好的检测板,每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100μL(对照为
8、正常兔血清),37℃孵育30min,洗涤3次后每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL,37℃孵育15min,洗涤3次后进行TMB显色,37℃孵育15min,终止反应后,用酶标仪测定样品的A450值。 1.2.7间接ELISA
