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《兔抗人细胞色素P4504A11合成肽抗体的制备与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、兔抗人细胞色素P4504A11合成肽抗体的制备与鉴定［摘耍］目的：制备兔抗人细胞色素P4504A11(CYP4A11)抗体，并对其特性进行初步鉴定。方法：利川生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列，根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、合成CYP4A11多肽，与载体贺白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联，免疫大耳口兔制备抗CYP4A11抗体。辛酸硫酸钱法纯化抗体，对纯化的抗体进行ELISA、Westernblot.免疫组化等鉴定。结果：获得抗CYP4A11合成肽的抗体。该抗体效价为1：32000o可与CYP4A11合成肽及天然CY
2、P4A11；11现特异性反应，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为53000,可识别止常肝脏的CYP4A110结论：合成的多肽KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、Westernblot、免疫组化等实验。［关键词］CYP4A11;合成肽；多克隆抗体人细胞色素P4504A11是细胞色素P4504A亚型0—，主要分布在肝脏和肾脏，其可以催化多种脂肪酸(月桂酸等)的代谢，调节体内脂类代谢平衡⑴。CYP4A11催化内源性花牛四烯酸代谢牛成20疑基II•碳四烯酸(20Hydroxyeicosa
3、tetraenoicacid,20HETE)，而20HETE与原发性高血压形成有关⑵。CYP4A11还参与防御紫外线氧化损伤的机制［3］0
4、
5、前对CYP4A11的研究正逐渐深入。国外已研究出重组CYP4A11抗休，而国内尚无这方血报道。因此我们制备CYP4A11的抗体，这将对CYP4A11的主理功能、组织定位以及与某些疾病的关系研究起重要的推动作用。1材料和方法1.1材料雄性大耳白兔6周龄，rh哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺(TMB)均
6、勾自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购JacksonImmunoResear
7、ch公司。牛血清白蛋tl(BSA)购口Solarbio公司。硝酸纤维素膜(NC)购口BIORAD公司。ECLPlus购自AmershamBiosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德牛物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、BSA的联接rtl北京中科亚光生物科技有限公司完成。止常人肝脏组织，rir人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。1.2方法1.2.1CYP4A11合成肽的设计利用DNAStar软件根据抗原指数(AntigenicIndex)、亲水性结构(HydrophilicityPlot)、柔韧区(Flexi
8、bleRegions)及表血概率结构(SurfaceProbabilityPlot)4个参数综合分析CYP4A11序列的特点，确定505〜519位15个氨基酸为欲合成的肽序列：RLRRLPNPCEDKDQL。1.2.2CYP4A11肽的合成及其与KLH和BSA的交联CYP4A11合成肽由北京屮科亚光生物科技有限公司采用合成肽自动合成仪合成；获得的合成肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化，纯度为96.9%oCYP4A11与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法，将5mg合成肽分别加入7mgKLH和BSA中，边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液(1
9、mL),室温作用2h°以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，交联形成CYP4A11KLH.CYP4A11BSA偶联物。1.2.3兔抗CYP4A11合成肽抗体的制备取200pg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射，每点约100MgQ2周后加强免疫，剂量同前,用不完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射；以后隔2周加强免疫1次；从第3次加强免疫开始，每次免疫后7d,经耳中央动脉采血测定抗体的效价，经过4次加强免疫后符合要求吋，立即颈动脉采血，分离血清后，无菌分装保存于-80°C备用。1.2.4人肝脏微粒体蛋白制备取正常人的肝脏
10、、剪碎，用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后，加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。采用差速离心（4°C,10000g离心30min,取上清液30000g离心60min,取上清100000g离心60min）,沉淀悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200mL/L甘油,5g/L胆酸钠,2mg/L抑肽酶,2mg/L亮肽素，1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟）中，用Bradford法进行蛋白定量后，:»-80°C保存备用。1.2.5辛酸硫酸镀法纯化合成肽抗体用醋酸钠缓冲液（60mmol/L,pH4.0）将抗血清稀释3〜4倍,0.1mol/LNaOH调节pH至4
11、.5,缓慢滴加辛酸至浓度为25mL/L,室温搅拌30mine4°C10000g离
