兔抗人cd1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定

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1、兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定作者：陈章权,黄震,梁晓东,何天文,陆田田【摘要】　　目的:制备兔抗人CD1d分子α3结构域（hCD1dα3）多克隆抗体。方法:PCR法扩增出人hCD1dα3编码区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导重组蛋白的表达,用Ni2+NTAAgarose亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、Westernblot及免疫组织化学法检测抗体。结果:成功构建了hCD1dα3原核表达载体pET28/hCD1dα3,高效表达并纯化hCD

2、1dα3蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6400,Westernblot显示该抗体能与hCD1d特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d。结论:通过制备重组hCD1dα3蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1dα3多克隆抗体。【关键词】CD1dα3结构域表达抗体制备　　[Abstract]AIM:Topreparetherabbitantibodyagainsttheα3domainofthehumanCD1d(hCD1dα3).METHODS:Thegenefragmentcod

3、ingforhCD1dα3wasamplifiedbyPCRandcloned12intoprokaryoticexpressionvectorpET28,thenexpressedinE.coliBL21(DE3).TherecombinantproteinhCD1dα3waspurifiedwithNi2+NTAagarosecolumnandusedasimmunogentoimmunizetherabbit.ThetiterandspecificityoftheantihCD1dα3antibodyfromtherabbitwereanalyz

4、edbyELISA,Westernblotandimmunohistochemistry,respectively.RESULTS:TherecombinanthCD1dα3wassuccessfullyexpressedandpurified,andthepolyclonalanithCD1dα3antibodywassuccessfullyprepared.Thetiteroftheantiserumwas1∶6400byELISA.Westernblotanalysisshowedthisantibodayreactedspecificallywit

5、hhCD1d.ImmunohistochemistryanalysisshowedtheantibodycouldrecognizethenativehCD1dinthehumanintestinaltissue.CONCLUSION:TheantiCD1dα3antibodyfromtherabbitwithhightiterandspecificityhasbeenpreparedwithpurifiedrecombinanthCD1dα3asimmunogen,whichlaysafoundationforfurtherresearchintodet

6、ectionandfunctionalstudyofCD1d.　　[Keywords]CD1d;α3domain;expression;antibody;preparation12　　CD1分子独立于MHC分子之外的一类特殊的抗原提呈分子。CD1d是其CD1家簇5个成员中的重要一员,它提呈的抗原主要为脂质分子,供NKT细胞识别[1],在免疫调节、NKT细胞的发育及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤疾病的发生发展过程中起重要作用[2-4]。CD1d分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成,其胞外区含3个结构域:从氨基端开始依次为α1、α2和α3结构域[5]。Kojo等[6

7、]发现CD1d分子存在α3结构域缺失的变异体,但尚未见进一步的生物学功能研究报道。我们在研究中也发现,在一些肿瘤患者体内存在类似的CD1d变异体,这些突变的CD1d分子存在的生物学意义尚不清楚,有待研究。抗体是研究免疫分子的重要工具,目前市场上尚未见有商品化的针对CD1d的α3结构域（CD1dα3）特异性抗体,也未见有该抗体制备的研究报道。为此,我们用通过PCR扩增获取了CD1dα3编码区基因,表达其重组蛋白,制备其特异性抗体,同时分析了其应用的可能性。　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)为本室保存。雄性新西兰大白兔由广

8、东医学院实验动物中心提供