兔抗人pon2抗体的制备与初步应用

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1、兔抗人PON2抗体的制备与初步应用【摘要】目的:制备兔抗人PON2(paraoxonase2)的多克隆抗体并进行初步鉴定。方法:生物信息学方法分析人PON2蛋白序列,选取人兔同源性较低,亲水性及免疫原性较强的片段,通过大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,获得GSTPON2融合蛋白用于免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,通过XX方法分离纯化得到的抗PON2多克隆抗体,用Westernblot、间接免疫荧光对其进行特异性及灵敏度鉴定。结果:成功获得了高表达的相对分子质量(Mr)为46000的PON2重组融合蛋白;Westernblot鉴定结果显示此多克隆抗体可特异识别肝脏总蛋白

2、、HeLa细胞及U937细胞中Mr为39000的天然PON2蛋白;间接免疫荧光结果显示此多克隆抗体所识别的蛋白定位于SY5Y细胞胞质中。结论:抗人PON2的多克隆抗体特异识别肝总蛋白、HeLa细胞及U937细胞中的天然蛋白,可用于PON2的研究及临床检测。【关键词】PON2多克隆抗体重组抗原　　人类PON（paraoxonase,对氧磷酶）基因家族有3个成员:PON1、PON2和PON3,它们在染色体长臂7q21.3-22.1上按照着丝粒PON1PON2PON3端粒的顺序排列。在哺乳类动物中,3个基因高度保守,在不同种属间,氨基酸水平上大约有79%～95%的同一性,

3、核苷酸水平上约有81%～95%的同一性［1］。PON1、14PON3表达主要受限于肝脏,而PON2在大部分组织中都有表达,如:脑、肝、肾及睾丸组织［2］。系统进化分析显示PON2是家族中最古老的成员。PON2主要在肝脏中合成,它能水解多种有机磷杀虫药的毒性代谢产物,并且能水解广谱的有机磷酸酯底物和许多芳香羧酸酯。此外,PON2还有抗氧化功能,防止LDL脂质过氧化,并且能够反转氧化LDL的氧化作用。PON2的同质异构体与许多的病理生理条件有关,包括:与原生质脂蛋白的变更,Ⅱ型糖尿病的葡萄糖水平,新生儿出生质量和冠心病的危险率［3-6］等现象有关。最近发现,PON基因家族与细胞

4、的不对称分裂也有密切的关系,在细胞不对称分裂中各种因素导致干细胞既有自我更新能力,又能生成继续分化的细胞。在导致细胞不对称分裂的因素中,命运决定子起着重要作用,而PON作为Numb配体在果蝇的干细胞样成神经细胞的不对称分裂中发挥重要作用,Numb抑制自我更新,且能被分配到注定分化的细胞中,而Numb的分配依赖于它与PON的相互作用,且PON在有丝分裂期间已呈不对称分布。由此可见PON对于细胞的不对称分裂研究具有重要意义。本研究中,我们以PON2为切入点,应用重组表达的PON2融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,并对抗体的特异性进行了鉴定,这为进一步研究PON2在代谢及

5、内分泌方面疾病,不对称分裂中的作用奠定了基础。　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌DH5α14及BL21(DE3)菌株为本实验室保存。pGEX４T1表达载体购于GE公司,pET32a表达载体购于Novagen公司。PCR回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于Omega公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于PIERCE公司。ExTaq酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购于日本TaKaRa公司。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购于Sigma公司。PVDF膜、ECL反应试剂盒购于Amersham公司。羊抗兔IgGHRP,FITC羊抗兔IgG、Hochest染核试剂、羊血清封闭液均购于北京

6、中杉金桥生物技术有限公司。扩增PON2部分片段的特异性引物由北京英骏生物公司合成。其上游引物序列为:5′CGGGATCCATGACAGTCAAACATGAGCTTCTTCCAAG3′,下游引物序列为:5′CCGCTCGAGTTAGAGTTCACAATACAAGGCTC3′,下划线部分为BamHI和XhoI的酶切位点。免疫用新西兰大耳白兔（雌性,2kg,120d）由军事医学科学院实验动物中心提供。　　1.2方法　　1.2.1PON2重组蛋白的原核表达及纯化搜索PON2的蛋白序列(HumanProteinReferenceDatabase,www.hprd.org),应

7、用DNAstar分析软件分析其亲水性,疏水性及可能的抗原表位,利用美国国立数据库（ncbi）的blast功能进行不同种属蛋白的同源性分析。选取同源性得分较低,亲水性及免疫原性得分较高的片段进行重组表达。PCR扩增所用模板为PON2的cDNA(由北京蛋白质组研究中心蛋白相互作用实验室惠赠),PCR产物经回收后,直接用BamHI和Xho14I双酶切,酶切产物分别与表达载体pGEX４T1和pET32a连接,连接产物转化至感受态DH5α中,涂板后37℃培养过夜,次日挑取单克隆,接种于含（0.1g/L）氨苄西林的LB培