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《小鼠抗人细胞色素P4501A2合成肽抗血清制备及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、小鼠抗人细胞色素P4501A2合成肽抗血清制备及鉴定作者：武正华，唐晓波王志刚纪宏宇；赵振营朱大岭毕业论文【关键词】；CYP1A2；,合成肽；，抗体；，小鼠毕业论文［摘要］;目的：制备小鼠抗人细胞色素P4501A2(CYP1A2)抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据4个指标(亲水性、柔韧性、抗原性及表面性)选择欲合成的多肽序列，设计、合成CYP1A2多肽。将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyholelimpethemocyanin,KLH)偶联，免疫BALB/c雌性小鼠制备抗CYP1A2抗体。用间接ELISA法测定抗体的效价,W
2、esternblot鉴定其特异性。结果：成功地获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1：16000,可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应。Westernblot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为58000o结论：合成的多肽KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的小鼠抗CYP1A2合成肽抗体的效价高及特异性良好。毕业论文［关键词JCYP1A2；合成肽；抗体；小鼠毕业论文CYP1A2和CYP1A1是CYP1A亚家族中仅有的两个成员［1］,它们在人体中的表达各有其组织特异性，CYP1A2主要在肝脏表达［2］,
3、也有在脑组织中检出CYP1A2mRNA而无蛋白表达的报道［3］。由于CYP1A2将某些杂环芳香族前致癌物激活代谢成致癌物，例如CYP1A2催化的食物烹调过程中产生的2氨基1甲基6苯基亚氨基［4,5b］毗噪的N2発基化激活反应，在化学致癌中起着非常重要的作用［4］,因此，研制CYP1A2抗体将对CYP1A2功能的研究以及抗癌药的研制、开发具有重要的理论意义和临床价值。本研究中研制小鼠抗CYP1A2的抗体并进行了部分特性鉴定，为后续的研究工作奠定了基础。毕业论文1;材料和方法毕业论文1.1;材料；福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺(TMB)均购自Sigma公司oHR
4、P山羊抗小鼠IgG购自JacksonImmunoResearch公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜购自BI0RAD公司。ECLPlus购自AmershamBiosciences公司。其他试剂均为国产分析纯。电动玻璃匀浆机(DY891型)为宁波新芝生物科技股份有限公司产品。酶标仪(MK3)为Thermo公司产品。电泳槽(DYCZ24D型)、电泳仪(DYY6B型)均为BIORAD公司产品。多肽合成及其与KLH、BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。6周龄BALB/c雌性小鼠，由哈尔滨医科大学动物中心提供。正常人肝脏组织，由“人类肝
5、脏蛋白质组计划”项目提供。毕业论文1.2；方法毕业论文1.2.1；CYP1A2抗原表位的分析；由SWISSPROT网站获知CYP1A2蛋白的序列，然后利用DNAStar软件分析其序列的特点，根据对其亲水性(hydrophilicity)、柔韧性(flexibility)、抗原性(antigenicity)及表面性(surfaceproperty)4个参数预测的结果，确定351〜365位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列：GRERRPRLSDRPQLP。毕业论文1.2.2；CYP1A2多肽的合成及其与KLH和BSA的交联;CYP1A2多肽由北京中科亚光生物有限公司采用
6、多肽自动合成仪合成；CYP1A2与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法［5］,将5mg合成多肽分别加入7mgKLH和BSA中，边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液(1mL),室温作用2ho以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜。交联形成CYP1A2KLH.CYP1A2BSA偶联物。毕业论文1.2.3；小鼠抗CYP1A2多肽抗体的制备［6］；<0.5mg多肽KLH偶联物加250；UL的去离子水与等量的完全福氏佐剂充分乳化后，于小鼠(2只)背部注射两点，每点约20ng,剩余的腹腔注射。3周后加强免疫，剂量同前，用不完全福氏佐剂充分乳化后，注射于小鼠腹腔；以后隔两周加
7、强1次；从第3次加强免疫开始，每次免疫后7d,经尾静脉采血测定抗体的效价，符合要求时，用不加佐剂的多肽KLH腹腔注射再加强免疫1次，3d后取血，分离血清后，无菌分装保存于-8（TC备用。毕业论文1.2.4；人肝脏微粒体蛋白制备；取10g正常人的肝脏、剪碎，用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后,加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4°C以10000g离心30min,取上清液，以30000g离心60min,取上清液及100000g离心60min,取粉红色沉淀后,悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200mL/L甘油，5g/L胆酸钠,2mg/L抑肽酶，2mg/L
8、亮肽素，1
