小鼠foxp3抗血清的制备及应用

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1、小鼠Foxp3抗血清的制备及应用作者：焦海春,肖建华*,何涛君,胡杰,崔彦芬【摘要】　　目的:制备高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清,并初步应用于正常小鼠组织的Foxp3表达的鉴定。方法:构建重组质粒pGEX6p2/Foxp3,并转化至E.coliBL21(DE3)中进行大量诱导表达,用纯化的重组融合蛋白免疫新西兰兔,制备抗血清。以制备的抗血清为一抗,Westernblot检测小鼠组织的Foxp3蛋白的表达。结果:SDSPAGE及Westernblot鉴定,诱导表达及纯化的重组融合蛋白能被抗GST单克隆抗体（mAb）识别,在Mr45000附近有特异条带

2、,与预期融合蛋白大小一致,获得的抗血清效价在1∶12800以上,该抗血清能特异性识别NIH3T3细胞中表达的Foxp3蛋白。Westernblot鉴定结果显示在脾脏、胸腺、淋巴结中Foxp3蛋白有较高表达,胃也有少量的表达,而骨骼肌、脂肪组织未见表达。结论:制备了高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清,并可用于正常小鼠组织的Foxp3蛋白的表达鉴定,为进一步研究Foxp3奠定了实验基础。【关键词】Foxp3CD4+CD25+Treg细胞抗血清制备　　[Abstract]AIM:Topreparethehightiterandspecificantiseruma

3、gainstmouseFoxp3andthenusethemtoidentifyFoxp3expressioninnormalmousetissues.METHODS:TheFoxp312fragmentwasamplifiedbypolymerasechainreactions(PCR)andclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpGEX6p2.TherecombinantplasmidpGEX6p2/Foxp3wastransformedintoE.coliBL21(DE3)tobeexpressed.T

4、heexpressedfusionproteinGSTFoxp3wasanalyzedbySDSPAGEandWesternblot.ThepolyclonalclantiserumwasobtainedbyimmunizingNewZealandrabbitswiththepurifiedfusionproteinasantigen.TheFoxp3expressioninnormalmousetissueswasdetectedbyWesternblotwiththeantiserum.RESULTS:Theexpressedproductswe

5、reanalyzedbySDSPAGEandWesternblot.Theresultsshowedthatthemolecularweightoftheexpressedproteinwasabout45000.Thetiteroftheantiserumwasabove1∶12800.WeobservedthattheantiserumcouldrecognizeFoxp3proteinexpressedinNIH3T3cellsbyimmunoblotting.WesternblotresultsshowedthattheFoxp3protein

6、wasexpressedhighlyinspleen,thymusandlymphnodes,lessexpressedinstomach,butnotexpressedinskeletalmuscleandadiposetissue.CONCLUSION:HightiterantiserumagainstmouseFoxp3isproducedandcanbeusedtoidentifytheFoxp3expressioninnormalmousetissues.　　[Keywords]Foxp3;CD4+CD25+Tregcell;antiserump

7、reparation12　　1995年,Sakaguchi等[1]发现CD4+CD25+调节性T淋巴细胞（regulatoryTcell,Treg）后,该细胞的研究成了近年来免疫学领域的研究热点之一。人们发现,Treg在自身免疫病、抗感染免疫、肿瘤免疫、移植物耐受等方面都具有重要意义。Foxp3基因属于转录因子forkhead/wingedhelix家族,该基因家族由大量分布极广的转录因子组成,该家族成员具有共同的保守序列“叉状头/翅膀状螺旋”DNA结合域。在Scurfy小鼠和人类IPEX综合征（immunedysregulation,polyendocr

8、inopathy,enteropathy,Xlin