资源描述：
《小鼠ocilrp2基因的克隆、 原核表达及抗血清的制备论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、小鼠OCILrP2基因的克隆、原核表达及抗血清的制备论文.freela公司产品。蛋白marker购自华美公司。DNAmarker购自鼎国公司。C57/B6小鼠及SD大鼠购自维通利华公司。原核表达载体pET28a及E.coliBL21（DE3）由本实验室保存。1.2方法1.2.1小鼠OCILrP2基因的克隆及重组表达载体的构建以C57/B6小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板,用Oligo4进行逆转录反应合成cDNA第1条链,再以上游引物（P1）5′AAAGAATTCTGGAAGTGGACAAACAACAC3′（含EcoRⅠ酶切位点）和下游引物（P2）5
2、′AATCTCGAGGACCATAGGGGAAAAAGTAG3′（含XhoⅠ酶切位点）进行,PCR扩增OcilrP2的部分cDNA。回收PCR产物（约为250bp）,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到表达质粒pET28a中的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,构建重组质粒pET28aOcilrP2。以重组质粒经转化大肠杆菌BL21（DE3）后,提取重组质粒,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,送上海博亚公司测序。1.2.2重组HisOCILrP2融合蛋白的诱导表达在3mL含卡那霉素的LB培养基中,接种转化菌鉴定正确的单个菌落,于37℃振荡培养10h,
3、再按1∶100的体积接种于10mL含卡那霉素的YT培养基中,于37℃、摇菌培养至A600=0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于37℃诱导8h。收集菌体,用PBS混悬后,进行超声裂解,离心裂解液,收集上清和沉淀（沉淀用PBS混悬）。将上清和沉淀均加蛋白上样缓冲液煮沸5min,以未经IPTG诱导的转化菌作为对照,进行SDSPAGE。1.2.3大鼠抗小鼠OCILrP2蛋白抗血清的制备SDSPAGE后,切取含有HisOCILrP2融合蛋白的凝胶条。将此胶条于PBS中研碎后免疫SD大鼠,初次免疫用弗氏完全佐剂,抗原量约为200μg/只
4、,于腹线两侧皮下多点注射。3周后,加强免疫,抗原量同首次,加弗氏不完全佐剂,以后每隔2周加强免疫1次,共免疫4次。最后1次免疫后7d,由颈动脉取血,分离血清冻存于-20℃中。1.2.4抗血清效价及特异性的4400凝胶成像仪检测发光信号。2结果2.1小鼠OCILrP2基因的克隆以P1和P2为引物,以小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板,经RTPCR扩增出约250bp的特异性基因片段,大小同预计结果相符（图1）。图1OCILrP2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析略2.2重组表达载体pET28aOCILrP2的构建构建的pET28aOCILrP2经EcoR
5、I和XhoI双酶切后,可得到1条约为250bp的片段（图2）。DNA测序结果与GenBank中登录的序列完全一致。图2重组质粒pET28aOCILrP2的酶切鉴定略2.3HisOCILrP2融合蛋白的表达及鉴定将含重组质粒的菌株经诱导和未经诱导8h后,收获菌体,进行SDSPAGE分析。诱导菌出现相对分子质量（Mr）约为10000的1条带,未诱导菌中没有此条带（图3）。采用抗HisTag的抗体进行r处出现1条特异性的带（结果未显示）。图3IPTG诱导HisOCILrP2融合蛋白表达的SDSPAGE分析略2.4大鼠抗OCILrP2抗血清的制备与鉴定大鼠
6、经4次免疫后,用r处出现1条特异性的带;而未免疫大鼠的血清则不与目的蛋白结合。抗血清的效价达1∶2000。进一步用本实验室制备的真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白进行,etal.Osteoclastinhibitorylectin,afamilyofne,2002,277:48808-48815.2CarlyleJR,JamiesonAM,GasserS,etal.MissingselfrecognitionofOcil/ClrbbyinhibitoryNKRP1naturalkillercellreceptorsJ.ProcNatlAcadSc
7、iUSA,2004,101:3527-3532.3TianulateTcellproliferationandIL2productionJ.CellImmunol,2005,234:39-53.4TianulationJ.CellImmunol,2005,235:72-84.5靳迪,饶恩于,李景鹏,等.NKRP1家族及其配体研究进展J.细胞与分子免疫学杂志,2006,22（1）:125-128.
