人胆固醇酯转运蛋白的cdna克隆、 原核表达及抗血清制备

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1、人胆固醇酯转运蛋白的cDNA克隆、原核表达及抗血清制备【摘要】目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP）cDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法:采用RTPCR方法,将人CETP基因克隆到pET30b(+)上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Westernblot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果:SDSPAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中

2、高效表达,最佳诱导表达时间为4h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105。Westernblot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础。【关键词】胆固醇酯转运蛋白原核表达抗血清　　[Abstract]AIM:Toclonehumancholesterylestertransferprotein(CETP)cDNA,expressan

3、dpurifyhumanCETPinE.coliandprepareCETPspecificrabbitantiserum.METHODS:byRTPCRmethod,theencodingsequenceofhumancholesterylestertransferprotein(CETP)wasclonedintopET30b(+)vector.Then13BL21(DE3)ofE.colitransformedwithrecombinantvectorpETCETPwasinducedtoexpressCETPinh

4、ighlevelbyIPTG.TheexpressedproteinwaspurifiedfromSDSpolyacrylamidegel,andtheantiserumagainstCETPwasraisedinrabbit.ThetiterandspecificityofrabbitantiserumwereevaluatedbyELISA,Westernblotandimmunofluorescenceassay.RESULTS:TheresultsofSDSPAGEshowedthatCETPwasexpressedi

5、ntheformofinclusionbodiesinBL21(DE3)andthebestexpressiontimewasabout4hours.ThetiteroftherabbitantiserumpreparedwithCETPpurifiedfromSDSPAGEwas1∶5.12×105andtheantiserumreactedspecificallywithCETPexpressedinBL21(DE3)andCOS7cells.CONCLUSION:Thepreparationofthespecificrab

6、bitantiserumagainstCETPwillbevaluableforthestudyonthestructureandfunctionofhumanCETP.　　[Keywords]cholesterylestertransferprotein;prokaryoticexpression;antiserum　　[摘要]目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP）cDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法:采用RTPCR方法,将人CETP基因克隆到pET30b(+)上,构建CETP原

7、核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,13切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Westernblot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果:SDSPAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105。Westernblot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、

8、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础。　　[关键词]胆固醇酯转运蛋白;原核表达;抗血清人胆固醇转运蛋白（cholesterylestertransferprotein,CETP）是一个极度疏水的糖蛋白,包含47