人白介素24 cdna克隆、突变纠正和原核表达论文

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1、人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达论文魏丽丽，李成华，袁成福，陈济，丁嵩涛，刘革力，易发平，宋方洲【摘要】目的获取人白介素24(IL24)cDNA.freelersham公司。淋巴细胞分离液购自鼎国公司。Trizol，BamHⅠ，XhoⅠ，pyrobestTMDNApolymerase，DNA连接试剂盒,引物的合成和重组质粒测序由TaKaRa公司完成。RT试剂盒购自TOYOBO公司。DNAmarker、小量质粒纯化抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。小分子量蛋白marker购自博大泰克公司。抗谷胱甘肽S转移酶(glutathioneStransferas

2、e,GST)抗体及其二抗购自Merck公司。1.2IL24的基因克隆通过淋巴细胞分离液分离健康人静脉血的外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)，用Trizol提取其总RNA,通过RTPCR扩增IL24cDNA，RT反应体系：2μLRNA，1μLoligdT(20)，9μLRNasefreeddH2O70℃5min，冰浴10min，再加入4μL5×RTbuffer，2μLdNTPs，1μLRNaseinhibitor，1μL莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukaemiavirus,MMuLV)反转录酶30℃10m

3、in，42℃20min，99℃10min。根据GenBank中人IL24基因序列(登录号：NM006850)通过DNAStar软件设计IL24引物，并在引物的5′端引入酶切位点，上游引物a：5′CGGGATCCATGAATTTTCAACAGAGGCTG3′，下游引物b：5′CCGCTCGAGCTAGACATTCAGAGCTTGTAG3′(划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点)，管家基因G3PDH(glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase)引物序列：PrimerR：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′；PrimerF：

4、5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，扩出的片段长450bp。PCR反应体系：ddH2O8.4μL，10×PCRbuffer2μL,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL，引物a、b各2μL，PrimerR、F各0.4μL，cDNA3μL，DNA聚合酶0.2μL，94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min(30)，72℃10min。1.3原核表达载体的构建将PCR产物和pGEX4T2载体分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，胶回收试剂盒纯化，TaKaRa连接试剂盒连接16℃30min，转化E.coliDH5α感受态，酶切鉴定，将阳性克隆送TaKaRa公

5、司测序。1.4IL24cDNA点突变的纠正223位G突变为A，设计其纠正引物c、d；370位T突变为C，设计其纠正引物e、f,c：5′TCTTTCACAGCCCAGAAGGCT3′，d：5′AGCCTTCTGGGCTGTGAAAGA3′，e：5′TCTATTGTGGTAGTTTTTGAA3′，f：5′TTCAAAAACTACCACAATAGA3′(标有下划线的碱基是纠正点突变位置)，采用高保真DNApolymerase，通过PCR纠正突变。223位突变的纠正步骤：分别扩增ac、bd片段，扩增条件为94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃45s(30)，72℃10min，胶回收

6、后，回收的片段分别稀释10倍做为模板等量加入第二次扩增体系，再加引物a、b，94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min(30)，72℃10min。370位突变的纠正步骤除在分别扩增ae、bf片段时的退火温度改为54℃，其他相同。将最后的PCR产物与载体pGEX4T2分别经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接。酶切鉴定后测序，正确的载体命名为pGEXIL24。1.5诱导表达和SDSPAGE分析将测序正确的重组载体转化E.coliBL21(DE3)，37℃过夜生长，以1∶100比例转接含有终浓度为100mg/L氨卞青霉素的2×YT培养液中，37℃振荡培养至A600nm为

7、0.6时，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，30℃继续培养3h；离心收集菌体，裂解沉淀，用BioRad垂直平板电泳仪以60g/L的浓缩胶及150g/L的分离胶跑SDSPAGE，通过考染分析结果。1.6C的总RNA为模板，通过RTPCR扩增得到一条与IL24cDNA大小相符的条带，出现在2、3泳道，大小为450bp的条带是管家基因G3PDH的产物(图1)。2.2原核表达载体的构建PCR产物和pGEX4T2载体分别用Ba