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1、小鼠OCILrP2基因的克隆、原核表达及抗血清的制备作者：靳迪饶恩于李景鹏赵勇【关键词】小鼠OCILrP2;,原核表达;,抗OCILrP2抗血清 [摘要]目的:在原核系统中表达破骨细胞抑制凝集素家族成员之一OCILrP2基因,并制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。方法:应用RTPCR从小鼠脾细胞中克隆的部分OCILrP2cDNA,构建重组表达载体pET28aOCILrP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达HisOCILrP2融合蛋白。以表达产物免疫SD大鼠,制备大鼠抗OCILrP
2、2的抗血清。采用a公司产品。蛋白marker购自华美公司。DNAmarker购自鼎国公司。C57/B6小鼠及SD大鼠购自维通利华公司。原核表达载体pET28a及E.coliBL21（DE3）由本实验室保存。 1.2方法 1.2.1小鼠OCILrP2基因的克隆及重组表达载体的构建以C57/B6小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板,用Oligo4进行逆转录反应合成cDNA第1条链,再以上游引物（P1）5′AAAGAATTCTGGAAGTGGACAAACAACAC3′（含EcoRⅠ酶切位点）和下游引物（P
3、2）5′AATCTCGAGGACCATAGGGGAAAAAGTAG3′（含XhoⅠ酶切位点）进行,PCR扩增OcilrP2的部分cDNA。回收PCR产物（约为250bp）,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到表达质粒pET28a中的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,构建重组质粒pET28aOcilrP2。以重组质粒经转化大肠杆菌BL21（DE3）后,提取重组质粒,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,送上海博亚公司测序。 1.2.2重组HisOCILrP2融合蛋白的诱导表达在3mL含卡那霉素的LB培养
4、基中,接种转化菌鉴定正确的单个菌落,于37℃振荡培养10h,再按1∶100的体积接种于10mL含卡那霉素的YT培养基中,于37℃、摇菌培养至A600=0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于37℃诱导8h。收集菌体,用PBS混悬后,进行超声裂解,离心裂解液,收集上清和沉淀（沉淀用PBS混悬）。将上清和沉淀均加蛋白上样缓冲液煮沸5min,以未经IPTG诱导的转化菌作为对照,进行SDSPAGE。 1.2.3大鼠抗小鼠OCILrP2蛋白抗血清的制备SDSPAGE后,切取含有HisOC
5、ILrP2融合蛋白的凝胶条。将此胶条于PBS中研碎后免疫SD大鼠,初次免疫用弗氏完全佐剂,抗原量约为200μg/只,于腹线两侧皮下多点注射。3周后,加强免疫,抗原量同首次,加弗氏不完全佐剂,以后每隔2周加强免疫1次,共免疫4次。最后1次免疫后7d,由颈动脉取血,分离血清冻存于-20℃中。 1.2.4抗血清效价及特异性的4400凝胶成像仪检测发光信号。 2结果 2.1小鼠OCILrP2基因的克隆以P1和P2为引物,以小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板,经RTPCR扩增出约250bp的特异性基因片段
6、,大小同预计结果相符（图1）。 图1OCILrP2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 略 2.2重组表达载体pET28aOCILrP2的构建构建的pET28aOCILrP2经EcoRI和XhoI双酶切后,可得到1条约为250bp的片段（图2）。DNA测序结果与GenBank中登录的序列完全一致。 图2重组质粒pET28aOCILrP2的酶切鉴定 略 2.3HisOCILrP2融合蛋白的表达及鉴定将含重组质粒的菌株经诱导和未经诱导8h后,收获菌体,进行SDSPAGE分析。诱导菌出现相对分子质量
7、（Mr）约为10000的1条带,未诱导菌中没有此条带（图3）。采用抗His・Tag的抗体进行r处出现1条特异性的带（结果未显示）。 图3IPTG诱导HisOCILrP2融合蛋白表达的SDSPAGE分析 略 2.4大鼠抗OCILrP2抗血清的制备与鉴定大鼠经4次免疫后,用r处出现1条特异性的带;而未免疫大鼠的血清则不与目的蛋白结合。抗血清的效价达1∶2000。进一步用本实验室制备的真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白进行,etal.Osteoclastinhibitorylectin
8、,afamilyofne,2002,277:48808-48815. [2]CarlyleJR,JamiesonAM,GasserS,etal.MissingselfrecognitionofOcil/ClrbbyinhibitoryNKRP1naturalkillercellreceptors[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,101:3527-3532. [3]TianulateTcellproliferationandIL2product
