鹅呼肠孤病毒分离鉴定和σc基因克隆、原核表达及抗血清的制备

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1、王晨：鹅呼肠孤病毒分离鉴定和oC基因克隆、原核表达及抗血清的制备三鹅呼肠孤病毒分离鉴定和6C基因克隆、原核表达及抗血清的制备中文摘要江苏某鹅养殖场发生一种仅感染雏鹅并以出血性坏死性肝炎为特征的病理变化和显微病理变化的传染性疾病。本实验室从发病鹅场采集患病雏鹅的肝脏为病料，接种SPF鸡胚分离病毒，通过临床症状及剖检病变、序列比对等方法对分离的病毒进行鉴定，结果表明该分离株病毒属于呼肠孤病毒。通过绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚、14日龄鹅胚均能引起规律性死亡和特征性病变，但经过尿囊腔途径接种病毒的鸡胚和鹅胚并不会死亡。该尿囊液病毒接种原代鸡胚成纤维细胞

2、未观察到明显的细胞病变，细胞生长良好。含病毒的尿囊液、绒毛尿囊膜及胚体对鸡胚、鹅胚的半数致死量(LD50)分别为10乏76、10引8、10‘39、10‘4～、10’37、10‘4一；用收集的尿囊液接种1、30、80日龄鹅，1日龄雏鹅部分发病死亡，其他鹅均无明显的临床症状。另外，血凝试验验证了该病毒无血凝性。ARV的oC蛋白是S1基因的第三个开放性阅读框编码的蛋白，有多种存在形式，是ARV外壳蛋白的重要组成部分，cC蛋白可能诱导产生中和抗体。oC蛋白和细胞的吸附性相关，启动了病毒的感染过程，第三个ORF基因缺失部分会导致病毒吸附能力的下降，因此cC蛋白在病

3、毒的感染和致病作用上有比较重要的作用。根据NCBI上已发表cC基因的基因序列设计了一对特异性的引物，采用RT．PCR方法扩增oC基因片段，将oC基因与T载体相连，把连接产物转入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，在含IPTG和X．gal的氨苄LB平板上筛选出白色菌落，提取质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行初步判断，再送测序鉴定，克隆的基因片段大d'为797bp；克隆到pGEX．6P．1表达载体上，获得重组质粒pGEX．oC，将重组质粒pGEX．oC转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，37℃，0．1mMIPTG诱导5h，通过SDS．PAGE电泳分析证实eC基

4、因获得了表达，重组蛋白分子量分别约为55KD，命名为GST．eC。以GRV阳性血清为一抗，经Western．blot分析证实表达的融合蛋白抗原性良好。用重组菌(pGEX．oC)诱导表达融合蛋I刍(GST．oC)，经过纯化后的蛋白作为免疫原，免疫2．5kg左右的新西兰白兔2只。三次免疫后用间接ELISA方法检测抗体效价，抗体的有效稀释效价为1：6400。制备高效价的抗体是验证基因表达和研究基因功能的首要前提，因为该病发现相对其他病毒来说的时间还很短，目前对诊断GRV感染的主要方法是病毒的分离鉴定和扬州大学硕士学位论文琼脂扩散实验，而融合蛋白的表达和抗血清的

5、制备可促进该蛋白进行抗原性分析、制备GST．oC抗体及亚单位疫苗等相关研究的开展。关键词：呼肠孤病毒；oC基因；克隆表达；抗血清王晨：鹅呼肠孤病毒分离鉴定和OC基因克隆、原核表达及抗血清的制备Isolationandidentificationofgoosereovirusandcloning、expressionofitssigmaCandpreparationofpolyclonal·●_'●antibodiesAbstract3一AgoosefarmsinJiangsuhappenedanewinfectiousdiseasewhichinfect

6、sgoslingsonly．Thepathologicalchangeofthediseaseischaracterizedbyhemorrhagicnecrotizinghepatitis．WeinoculateSPFchickenembryoswiththetreatedcollectionsinadvancewhichcomefromdiseasedgoslings’Snecrosicliver，andidentifyvirusthroughthewayofclinicalsymptoms，autopsylesionsandsequencecomp

7、arison．TheresultsofexperimentsshowthattheseparationofthisvirusCancauseregularlydeathandcharacteristicpathologicalchangesof10day-oldSPFchickenembryos，14day-oldSPFgooseembryos，whichisinoculatebythewayofchorioallantoicmembrane．Butthechickenembryosandgooseembryosdonotdiewhichisinocul

8、atebythewayofallantoiccavity．Theallantoi