马铃薯Y病毒HCPro和甘蔗花叶病毒CP基因的克隆、原核表达与抗血清制备

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1、山东农业大学硕士学位论文马铃薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花叶病毒CP基因的克隆、原核表达与抗血清制备姓名：石鹏君申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李向东20040613中文摘要血清学方法是植物病毒诊断和鉴定病毒的重要方法，在植物病毒的检疫、预测预报、植物病毒的定位、增殖、移动和基因功能等方面研究中也发挥着重大作用。以往用提纯的病毒粒体为抗原制备抗血清存在一些缺陷，如有些病毒含量非常低、不易提纯，所得抗血清中常含有寄主蛋白的抗体等。通过基因工程技术使病毒的基因在原核细胞中表达，以表达产物作为抗原制备抗血清，可以部分解决以上问题。本研究主要结果如下：1分别以马铃薯Y病毒(Pota

2、tovirusy，PVY)N和O株系分离物的RNA为模板，通过RT-PCR克隆到PVY“、pVyoHC-Pro基因，并对其进行了序列分析。测序结果表明两个HC—Pro基因全长均为1368nt，编码456个氨基酸。两个基因的核苷酸同源性为99．71％，氨基酸同源性为99．56％。2将PVY“HC．Pro基因克隆到pET22b(+)上，构建了原核表达载体pETHC，使HC．Pro基因在大肠杆菌中得到高效表达。用原核表达的HC．Pro免疫家兔，获得了HC-Pro的抗血清。3应用RT-PCR和特异引物从泰安采集的感染矮花叶病的玉米植株总RNA中扩增到一个大约1kb的片段，与克隆载体pUCl8

3、连接后通过热激法转化大肠杆菌DH5ct。序列测定和结果的表明，泰安地区玉米花叶病由甘蔗花叶病毒(SCMV)引起，该病毒泰安分离物(scMV一1A)CP基因含939个核苷酸，编码313个氨基酸。泰安分离物和国内报道的SCMV分离物(特别是山东分离物)有很高的氨基酸序列同源性，而与其它病毒的同源性较低。4将SCMV-TA的外壳蛋白基因克隆到表达载体pET22b(+)，并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，表达蛋白约占总蛋白的15％。用此蛋白制备了效价高、专化性强的抗体。关键词：马铃薯Y病毒；辅助成分一蛋白酶；甘蔗花叶病毒；外壳蛋白基因；克隆；原核表达AbstractSerolog

4、icalmethodshavebeenprovedtobesensitiveandspecificindetectingandidentifyingviruses．Theyalsoplayedgreatrolesinstudyinglocalizationofviralproteins，functionsofviralgenes，transmissionmechanism，andvirus—hostinteractions．However,therewereseveralpotentialdisadvantagesforserologiealstudies．Forexample，so

5、mevirusesexistedinplantsatverylOWconcentrationandweredi伍cultto1)epurified．Someantiseracontainednon．specificantibodiestohost03nstituents．AntibodyraisedagainstviralproteinexpressedinE．colimightpartlysolvetheseproblems．111emainresultsofthisstudyread嬲follows：1．TheHC．ProgenesofPVyNandPVyOwereamplifi

6、edlwRT-PCRandtheitcompletenucleotidesequencesweredetermined．111eresultsshowedthattheyallcomposedof1368nt，eachencodedflprateinof456aminoacids．Sequencecomparisonshowedthesetwogeneshadanidentitvof99．71％atnucleotideleveland99．56％ataminoacidlevel．Ⅱ忙YsharehigherhomologywithotherstrainsofPVYthanwithot

7、hervirusesofPotyvirus．2．TheHC．ProgeneofPVY“wasclonedintoexpressionvectarpET22b(+)andtrailsferredintoE．colfBL21(DE3)．SDS．PAGEshoweditcouldbeexpressedtohi出levelwheninducedwithIPTGthemolecularweightofthefusionproteinisca．53kD．nle53kD