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《1986 鱼呼肠孤病毒_frv_抗血清的制备及其应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、甲..第10卷第4期水产学报Vol飞0No4.1日8612JOURNALOrFI3HERIESOFC习江NADeo,16年月始鱼呼肠孤病毒(FRV)抗血清的制备及其应用阂淑琴洪世雯蔡宜叔(中国科学院武汉病毒研究所),。提要在rRV的分离和纯化基础上本文介绍了制备rRV抗血清的几种方法并采用不连续对流免疫电泳法(DCIE)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行FRV诊断学研究结,。果同时对这两种方法检测FRV的灵敏度作了比较、、主题词鱼呼肠孤病毒草鱼出血病抗血清,。草鱼出血病是一种严重的鱼类病毒病造成草鱼大批死亡
2、研究该病的防治对于我国淡水渔业的发展具有十分重要的意义。目前〔工J,已有一些单位采用粗制疫苗进行预防。,、并开始细胞疫苗等方面的防治研究工作但迄今为止尚未建立灵敏可靠的血清学诊断。FRV)为该方法来预测该病的检测和预防效果我所曾报道了鱼呼肠孤病毒(简称病的〔,“,。,病原建立了稳定的提纯FRV的方法并在此基础上成功地制备出几种FRV抗血,(D清对不连续对流免疫电泳法OIE)和酶联免疫吸附试验(且LISA)诊断FRV作了研,。。究比较了这两种方法对检测FRV的灵敏度本文介绍这方面的研究结果材料和方法.〔,1FR
3、V杭原及其纯化将泞V一836毒株们感染健康草鱼种取感染后发病的草。。鱼组织按文献〔幻的方法提纯提纯后的抗原样品在电镜下观察可见大量病毒粒子紫·:8。二2。外分光光度计测定并使OD74,,2兔rRV杭血清的制备选用2公斤以上健康家兔采用胭淋巴结免疫脚为基础、.,,,免疫途经即在兔胭窝处割一小切口可见一淡红色黄豆粒大小的胭淋巴结将oZml提纯的,,。抗原和等量的完全福氏佐剂乳化液注射到淋巴结内缝合皮肤完成基础免疫在基,·础免疫后第14天进行第一次加强免疫即于两侧鼠蹊皮下各注射。2ml提纯抗原和等,,.2量的不完全
4、福氏佐剂乳化液第21天进行第二次加强免疫在两侧臂部肌肉各注射0ml。9,。提纯抗原和等量的不完全福氏佐剂乳化液天后胫静脉采血得到免疫兔抗血清用正,O,r常草鱼组织经同样提纯处理后的材料做为吸附液于37C保温1小时后于40oopm条,。件下离心30分钟去沉淀后得到兔FRV抗血清3.鱼36800OFRV杭血清的制备将rV一8感染的病鱼组织在捣碎器内于rP功,,条件下搅动15分钟制成的匀浆用适量磷酸缓冲生理盐水(PBs)稀释后用4000rPm速,,,。,Z度离心20分钟去掉组织碎片及其杂质加入青链霉素于370保温1
5、小时将Oml水产学报10卷,O,,此病毒样品从腹腔处注射到健康草鱼中在28C饲养取15天后仍存活的草鱼血清获卫RV抗血清。得鱼.12,4鼠FRV杭血清的制备选周龄BALB/C小白鼠基础免疫于腹腔内两侧各注射0.2ml提纯抗原和等量的完全福氏佐剂乳化液。在基础免疫后第21天和第30天、.。,分别进行第一二次加强免疫均于两侧腹腔内各注射02ml提纯抗原徉品7天后采,。血用ELISA法检测抗体5.免疫复合物的电镜观察将制备出的兔FRV抗血清与FRV样品按1:l。混合,于37℃保温l,于endorf离心机离心10分钟
6、后,,后小时E孙弃去上清液沉淀溶于少.,。,,量重蒸馏水中滴于碳膜覆盖的火棉胶膜铜网上用2%磷钨酸pH69负染色在JEM一。10C电子显微镜下观察.,6兔抗FRVI酮的提纯免疫兔FRV血清用中性饱和硫酸按沉淀后经e,,DEAE一s仙adexA50柱层析得到纯化的抗卫RVlgG经聚丙烯酞胺凝胶电泳及醋酸,r。纤维素薄膜电泳检测在区呈现一条蛋白质区带紫外分光光度计测定其蛋白含量为.。2697mg/ml.7辣根过氛化物酶(HRP)标记兔杭FRVIgG按郭春祥等人的改良过碘酸盐法[.]。·.,二2一。进行所用且RP为
7、上海生化所生产RZ53...一8不连续付流免疲电泳法(DCIE)用0ol5M巴比妥钠盐酸缓冲液印且84)配。..。,一,制75终琼脂电泳槽缓冲液为0075汀巴比妥钠盐酸缓冲液(pHS4)电泳电压为每,。厘米5伏左右60分钟观察结果9.〔。酶联免疫吸附试验(ELIsA)按常规ELIsA双抗体夹心法引检测咫v抗原,。采用上海塑料三厂生产的40孔聚丙乙烯微量反应板包被抗体为纯化的兔抗FRV址G2林g,一:1,通过棋盘滴定选择包被抗体浓度为/孔HRPFRV结合物稀释度为10底物采。。用磷苯二胺肉眼观察结果E。。按常规
8、LISA间接法闭检测FRV抗体采用上述微量反应板经棋盘滴定选择:,吸附抗原浓度为190稀释度的FRV提纯抗原酶标结合物采用北京生物制品所生产的,。。辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠BALB/C结合物底物采用磷苯二胺肉眼观察结果结果和讨论1.rRV抗血清,,,制备成的兔免疫血清经正常鱼材料吸收后得到兔rRV抗血清经DoIE法检测,,:,与FRV抗原呈现一条沉淀线与正常鱼比较无血清学反应其抗体滴度为132而采
