禽呼肠孤病毒诱导细胞自噬的机制及其与病毒复制的关系

《禽呼肠孤病毒诱导细胞自噬的机制及其与病毒复制的关系》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、姜珂：禽呼肠孤病毒诱导细胞白噬的机制及其与病毒复制的关系!禽呼肠孤病毒诱导细胞自噬的机制及其与病毒复制的关系研究生：姜珂导师：吴艳涛教授(扬州大学兽医学院，江苏扬州，225009)摘要：禽呼肠孤病毒(ARV)是家禽重要疾病之一，主要感染鸡和火鸡，常与其他疾病混合感染，并引起免疫抑制。虽然ARV感染已被证实可诱导宿主细胞凋亡，但ARV与其靶细胞之间的相互作用关系，需进一步研究。为了探讨ARV分离株GX／2010／1感染细胞后对自噬的影响，我们首先用表达GFP．LC3融合蛋白的重组质粒分别转染非洲绿猴肾细胞(Vero)和鸡胚成纤维细胞(CEF)，然后再感

2、染ARV分离株GX／2010／1，利用荧光显微镜观察GFP．LC3在细胞内形成的聚点。结果显示，ARV感染组和雷帕霉素处理组发生聚点的细胞显著多于对照组。进一步采用透射电子显微镜对ARV感染的Vero细胞中形成的自噬泡进行观察。结果显示，经ARV感染的Vero细胞中可观察到许多典型自噬结构，比如杯状体、肿胀的线粒体、白噬体双层膜结构等。因为LC3II表达量通常作为自噬发生水平的标志，我们通过免疫印迹的方法检测ARV分离株GX／2010／1感染Vero细胞和CEF细胞中LC3．II／B．Actin比值的变化，发现ARV感染组和雷帕霉素处理组LC3．II

3、／[3．Actin比值均显著升高，并在病毒感染早期促进自噬，在病毒感染晚期则抑制白噬。进一步检测p-mTOR／B—Actin和p-Akt／[3．Actin的比值，结果表明I型P13刚Akt／mTOR信号通路依赖于自噬发生。为了探讨宿主细胞自噬对ARV分离株GX／2010／1复制的影响，我们对药物诱导和抑制Vero细胞和CEF细胞自噬的条件进行优化，结果显示100nM雷帕霉素和50gM的氯喹可分别显著诱导和抑制宿主细胞自噬。采用以上浓度预处理Vero和CEF细胞，然后感染病毒，TCID50法测定细胞培养液上清中子代病毒的滴度，发现自噬诱导剂雷帕霉素可提

4、高ARV分离株GX／2010／1感染宿主细胞的病毒复制水平，而自噬抑制剂氯喹则通过抑制白噬溶酶体的形成，致使病毒滴度降低。表明细胞自噬对ARV复制具有促进作用。总之，本研究证实了自噬决定ARV分离株GX／2010／1感染细胞的病毒产量，有助于深入探讨ARV与宿主细胞相互作用，也为ARV的防治策略提供新思路。关键词：禽呼肠孤病毒；自噬；病毒复制扬州火学硕士学位论文AutophagyInducedbyAvianReovirusInfectionandItsRelationshipwithViralReplicationCandidate：JiangKeS

5、upervisor：Prof．WuYantao2一Abstract：Avianreovirus(ARV)isanimportantcauseofdiseaseinpoultryandmainlyinfectedchickensandturkeys．ARVmixedinfectionwithotherpathogensmaycauseimmunosuppressive．AlthoughARVisknowntoinduceapoptosisininfectedcells，theinteractionbetweenARVanditstargetcellsr

6、equiresfurtherelucidation．InordertostudytheeffectofARVstrainGX／2010／1infectiononautophagy,Veroandprimarychickenembryonicfibroblast(CEF)cellsweretransfectedwithaplasmidGFP。microtubule‘associatedprotein1lightchain3followedbyARVinfection，thepresenceofGFP-LC3punctainVeroandCEFcells

7、wereobservedbyfluorescencemicroscopy．ItwasshownthatmorepunctasappearedinARV-infectedandrapamycin．treatedcellsthaninmockcells．Tofurthervalidatetheseresults，weobservedautophagosomeformationinARV-infectedcellsbytransmissionelectronmicroscope．Manytypicalstructuresofautophagycouldbe

8、seeninARV-infectedcells，suchascup—shapedmembranousstru