自噬现象与乙肝病毒复制的关系

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1、学校代码：10023学号：200401069自噬现象与乙肝病毒复制的关系专业年级：北京协和医学院临床医学专业2004级姓导名：傅麒宁师：毛一雷(教授)北京协和医学院临床学院(北京协和医院)肝脏外科完成日期：2012年6月目录自噬现象与乙肝病毒复制的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

2、．．．．．．．．．．．．．．．．3缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’／'I旨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43综述：自噬

3、现象在肝脏疾病中的角色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54在学期间发表论文及参与课题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63学位论文版权使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64自噬现象与乙肝病毒复制的关系摘要【研究目的】通过研究自噬现象在乙肝病毒复制中所扮演的角色，寻找降低乙肝病毒复制的新途径，并通过对其机制的研究，探讨该现象对于宿主

4、细胞生存的影响及其致癌性的可能机理。【研究方法】1．用HepG2．2．15细胞系和pUCl857-1HBVl．2质粒转染的HepG2细胞系构建出有HBV复制的细胞系；2．采用3．甲基腺嘌呤和无胎牛血清培养基作为自噬现象的干预手段，使用HepG2细胞系和pUCl8质粒转染的HepG2细胞系作为对照，通过测量上清中HBV拷贝数评估HBV复制情况，并对细胞裂解液采用蛋白免疫印迹法(WesternBlotting)对自噬水平进行分析；3．使用GFP．LC3质粒转染的细胞及HBcAg免疫荧光抗体，通过荧光显微镜对HBV复制和自噬的水平进行评估；4

5、．采用WST．1试剂及酶标仪测定，对细胞增殖状态进行评估。【研究结果】1．HepG2．2．15细胞系和pUCl857-1HBVl．2质粒转染的HepG2细胞均有HBV产生和分泌。2．有HBV复制产生的细胞系——_HepG2．2．15细胞系或pUCl857—1HBVl．2质粒转染的HepG2细胞中，P62蛋白水平的下降，LC3．II／LC3-I比值升高，说明HBV复制有诱导自噬的作用。3．在HepG2．2．15细胞系中，使用lmM浓度的自噬抑制剂3-MA，可以减少上清液中HBV的拷贝数。但是对于10mM浓度的3-MA，以及不含FBS的乏营

6、养培养基对上清中HBV拷贝数的影响尚缺乏具有显著性差异的结论。4．转染pEGFP．C1．LC3质粒HepG2细胞中，GFP—LC3融合蛋白弥散在胞浆中。而转染pEGFP-C1一LC3质粒的HepG2．2．15细胞可以看到多个明亮的绿色荧光斑点。并且LC3斑点数量与HBcAg荧光斑点数量有一定程度的相关性，但两者未表现出共定位。5．在无血清培养基的饥饿状态下，有HBV复制的细胞系增殖更快，加入10mM的3-MA则会抑制这种增殖。提示HBV所上调的自噬有利于细胞在极端情况下的生存。【结论】乙肝病毒可以提高其宿主细胞中自噬的水平，但自噬对于乙

7、肝病毒的复制、产生的意义以及具体的机制还有待于进一步探索。同时乙肝病毒也许有利于宿主细胞在应激情境下生存状态，但这种影响还需进一步的试验验证。更深入的研究也许将为我们治疗乙肝病毒感染，阻止或减缓慢性乙肝病毒感染向肝硬化、肝癌进展提供新的思路。【关键词】乙肝病毒；复制；自噬TheRelationshipbetweenHepatitisBVirusReplicationandAutophagy[Objective]AbstractInthisstudy，wetrytoexploretheroleautophagyplayinhepatiti

8、sBvirusreplication，whichmayprovideanewwayforthetreatmentofHBV．Wealsotrytoinvestigatewhetherthemechanism