桃拉综合症病毒和草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白抗体的制备与分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090104223上海海洋大学硕士学位论文桃拉综合症病毒和草鱼呼肠孤病毒外壳论文题目：蛋白抗体的制备与分析Preparationandanalysisofantibodies英文题目：againsttheoutercapsidproteinsofTaurasyndromevirusandGrasscarpreovirus专业：临床兽医学研究方向：水产动物病原学姓名：杨倩指导教师：吕利群教授二〇一二年四月六日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚

2、严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

3、索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注王永杰上海海洋大学教授主席严继舟上海海洋大学教授委员中山医科大学附属第一徐红旭研究员委员医院许丹上海海洋大学讲师答辩秘书水产与生命学院D楼答辩地点答辩日期2012-05-19101上海海洋大学硕士学位论文摘要水产动物病毒性疾病给水产养殖业带来了严重危害。桃拉综合症病毒（Tau

4、rasyndromevirus，TSV）和草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）分别是感染南美白对虾和草鱼的主要病原，严重影响了其养殖业的健康发展，因此展开对这两种水产动物病毒结构蛋白的研究显得尤为必要。TSV隶属双顺反子病毒科（Dicistroviridae），蜜蜂麻痹病毒属（Aparavirus）；其基因组大小约为10kb，包含两个开放性阅读框架（ORF），ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码三种结构蛋白：VP1，VP2，VP3。GCRV隶属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus）

5、，其基因组共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。其中VP7是一种结构蛋白，由S10基因组片段编码，与VP5蛋白形成异源二聚体进而形成外壳蛋白层；VP7蛋白可以结合dsRNA，与病毒的细胞吸附有关。本研究对TSV结构蛋白基因vp2、vp3进行了克隆表达，并对结构蛋白VP2、VP3及GCRV病毒外壳蛋白VP7进行了表达纯化、相应的多克隆及单克隆抗体的抗体制备，主要内容如下：1．桃拉综合症病毒结构蛋白基因vp2、vp3的克隆表达及抗体制备根据GeneBank中桃拉综合症病毒的全基因组序列，分别设计该病毒的主要结构蛋白基因vp2、vp3

6、的对应引物，提取感染TSV的南美白对虾中的总RNA并以此为模板，利用RT-PCR技术对目的基因进行了扩增;将目的基因vp2和vp3分别克隆到表达载体pET-16b-1和pGEX-4t-3质粒中，并转化入EscherichiacoliBL21（DE3）和DH5α中。经IPTG诱导和SDS-PAGE分析后，分别获得大小分别为42kDa和48kDa的重组蛋白VP2和VP3，且两种目的蛋白均以包涵体形式存在。将蛋白胶上目的蛋白条带割胶纯化并作为多抗制备的免疫原获得抗VP2血清（P-vp2）和抗VP3血清（P-vp3）。单克隆抗体的制备

7、以合成的VP2及VP3多肽为免疫原，经BALB/c小鼠免疫、细胞融合及克隆亚克隆筛选获得杂交瘤细胞，对培养上清液纯化后获得抗VP2单克隆抗体（M-vp2）和抗VP3单克隆抗体（M-vp3）。Westernblot分析显示四种均可与体外表达的蛋白发生特异性免疫反应，且与大肠杆菌中其他蛋白无交叉反应。Immunodot-blot结果显示两种多抗血清与两种单克隆抗体均可以从TSV感染的对虾中检测到VP2蛋白和VP3蛋白；同时，单克隆抗体对TSV结构蛋白的特异性较多抗血清高；单克隆抗体M-vp2的效价较单克隆抗体M-vp3略高。该结果

8、为TSV的免疫检测方法的建立提供了技术基础，为实现TSV的免疫学防控提供了可能。上海海洋大学硕士学位论文2．草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白VP7的表达及单克隆抗体的制备将体外构建的VP7表达质粒转化至EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，经IPTG诱导后，获得重组蛋白V