草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用机制及入侵途径研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150104135上海海洋大学硕士学位论文草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用机制题目：及入侵途径研究Researchontheinteractionbetweenouter英文题目：capsidproteinsofgrasscarpreovirusandpathwayinvolvedinviralcellularentry专业：临床兽医学研究方向：水生动物疾病学姓名：刘玮莎指导教师：吕利群教授二O一八年四月一日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在

2、导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位

3、论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注刘万红武汉大学教授主席黄赞武汉大学教授委员徐鸿绪中山大学教授委员张俊斌深圳大学教授委员姜有声上海海洋大学副教授委员王浩/喻博士/博士上海海洋大学秘书飞生答辩地点病原库会议室101答辩日期20180519上海海洋大学硕士学位论文摘要草鱼呼肠孤病毒是一具有高致死性和高传染性从而造成草鱼出血病的主要病毒病原，属于水生呼肠孤病毒属并且是该属中致病力最强的毒株之一。其病毒主要分为三种基因型，分别是以GCRV873为代表株的Ⅰ型、GCRVHZ0

4、8为代表株的Ⅱ型和以HGDRV（GCRV104）为代表株的Ⅲ型。本课题的研究主要利用现代分子生物学技术，验证草鱼呼肠孤病毒粒子负责识别吸附宿主的外衣壳蛋白VP5和VP7二者之间相互作用的关系，以及不同基因型GCRV在细胞内的增殖动态和其病毒进入细胞的机制，主要研究内容如下：1.GCRV外衣壳蛋白VP5与VP7之间相互作用结构域的鉴定及分析草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7位于病毒粒子最外层形成异源二聚体，负责识别吸附宿主细胞，进而侵染宿主。本章节研究通过酵母双杂交体系初步证实了VP5和VP7之间存在相互作用，并通过原核表达和杆状病毒表达系统分别表达VP5和VP7蛋白，进行Dot-Bl

5、otOverlay实验进一步证实二者之间相互作用。为初步验证VP5和VP7蛋白之间相互作用结构位点，分别对编码VP5和VP7蛋白基因进行截断，以截断后基因表达蛋白和全长基因表达蛋白进行酵母双杂交实验，结果显示，VP5截断后基因表达蛋白与VP7全长基因表达蛋白全部存在相互作用，而VP7截断基因表达蛋白与VP5全长基因表达蛋白不存在相互作用，因此我们推测，VP5与VP7蛋白之间的相互作用关系，其VP5蛋白上存在多个结合位点。2.两种基因型草鱼呼肠孤病毒的增殖动力学对Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRVJX01）和Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）两种基因型毒株感染宿主细胞的病毒增殖动力学进行比较，

6、分别在相同感染条件下感染两种株型病毒，根据不同时间点上清滴度的测定、以及病毒粒子在宿主细胞内的表达增殖量，研究其两种基因型草鱼呼肠孤病毒增殖动力学。结果表明，Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）与Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRVJX01）的侵染宿主细胞增殖感染过程相比较来看，Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）更加缓慢。依据先前对Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRVJX01）入侵途径的研究报道，本章I上海海洋大学硕士学位论文对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）入侵途径做一初步的探讨。根据NH4Cl和Dynasore抑制剂对应的通路途径，使用该两种抑制剂对CIK细胞进行相应处理后感染Ⅲ型草鱼呼肠孤病

7、毒（GCRV104），发现NH4Cl对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）感染宿主细胞CIK的抑制效果非常明显，Dynasore也具有较明显的抑制效果，因此我们得出结论，Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）是在低pH环境下，依赖于发动蛋白dynamin的作用侵染宿主细胞。3.Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）入侵途径的研究本章节中我们对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）入侵途径进一步地研究探讨。通过11种抑制剂进行相对应的通路筛