草鱼ajuba蛋白在草鱼呼肠孤病毒感染cik细胞过程中的表达及功能探讨

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1、学校代码：10264研究生学号：M120104139上海海洋大学硕士学位论文题目：草鱼Ajuba蛋白在草鱼呼肠孤病毒感染CIK细胞过程中的表达及功能探讨Expressionandfunctionalanalysis英文题目：ofgrasscarpAjubaproteinduringGCRVinfectionCIKcells专业：临床兽医专业研究方向：水产动物传染病学姓名：张娅楠指导教师：吕利群教授二O一五年四月十日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引

2、用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年

3、月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文草鱼Ajuba蛋白在草鱼呼肠孤病毒感染CIK细胞过程中的表达及功能探讨摘要Ajuba属于LIM蛋白第三类中的Zyxin蛋白家族，含有双锌指结构的LIM结构域，其主要作用是参与蛋白质之间的相互作用。Ajuba影响着生物体生长发育的基本过程——有丝分裂，调控细胞周期；是细胞骨架相关蛋白，参与细胞粘附及细胞间的信息交流；作为转录共抑制因子，参与调解不同的生理过程，甚至与肿瘤的发生相关。而且，Ajuba参与核转录因子蛋白家族NF-κB的激活反应，NF-κB能够调控很多与

4、早期免疫反应和炎症反应相关的分子。草鱼呼肠孤病毒引发的草鱼出血病，危及中国淡水养殖业，给渔民造成极大的损失。针对草鱼呼肠孤病毒分子结构及基因功能的研究是明确病毒侵染宿主机制的基础，而对草鱼呼肠孤病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用研究则是攻克草鱼出血病的重点和难点。基于此，本课题主要从以下几个方面进行研究：1.草鱼Ajuba基因的克隆与表达根据酵母双杂交技术获得的基因片段设计特异性引物，结合RACE技术，扩增得到草鱼Ajuba基因（gcAjuba）cDNA全长3980bp，GenBank登录号为KC551289.1。其中，5’非编码区1215bp，3’非编码区644bp，开放阅读框（O

5、RF）2121bp，编码706个氨基酸，分子量约为75.966kDa。等电点（pI）为7.87，不稳定系数为64.48。生物学分析，蛋白gcAjuba含有3个碳末端保守LIM结构域。氨基酸比对发现，gcAjuba与斑马鱼Ajuba氨基酸序列同源性最高，与哺乳动物Ajuba也具有较高的同源性。系统进化分析显示，gcAjuba与鱼类亲缘关系最近，与哺乳动物亲缘关系最远。2.GCRV-JX01感染下gcAjuba基因的表达研究为明确草鱼呼肠孤病毒感染条件下gcAjuba的表达模式，设计实验检测gcAjuba在GCRV-JX01感染后0h、4h、8h、12h、24h五个时间点转录水平表

6、达情况，使用相对定量的方法，以草鱼EF1a为内参基因，检测gcAjuba基因在不同时间的表达水平差异。结果显示，gcAjuba在GCRV-JX01病毒毒株感染刺激后4h达到最高表达量，且明显上调。说明gcAjuba基因是一个病毒可诱导基因，参与草鱼呼肠孤病毒侵染宿主途径。3.草鱼Ajuba与GCRVNS26相互作用的初步探究成功构建重组质粒pEGFP-gcAjuba和pcDNA3.1-NS26，共转入草鱼CIK细胞。亚细胞定位显示，草鱼蛋白gcAjuba和病毒蛋白NS26均分布于细胞质中，但两者I上海海洋大学硕士学位论文表达位置并没有完全重叠。应用免疫共沉淀技术，证明融合蛋白G

7、FP-gcAjuba和His-NS26之间没有直接相互作用。本研究成功克隆草鱼Ajuba基因，首次获得草鱼AjubacDNA序列全长，并对其蛋白序列进行结构与生物学分析，为进一步探究草鱼Ajuba的生物学功能做好铺垫。而且证明gcAjuba是草鱼呼肠孤病毒感染细胞下的可诱导蛋白，结合Ajuba参与免疫系统这一论断，为草鱼呼肠孤病毒的防控机制提供新的思路。然而，由酵母双杂交实验得出的gcAjuba与NS26的相互作用在体外实验中并未得到验证。可能需要从Ajuba蛋白自身的生物学修饰或者某种间接