兔抗人NDR2高效价抗血清的制备、纯化及鉴定.doc

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1、兔抗人NDR2高效价抗血清的制备、纯化及鉴定作者：张文红刘新平王吉村韩月恒邓艳春周洁药立波【关键词】免疫血清关键词:NDR2;基因，Myc表达；免疫血清;亲和纯化;易感性与特异性摘要：目的制备高效价的NDR2抗体•方法构建pRset-A-ndr2,pGEX-4T-l-ndr2-a和pGEX-4T-l-ndr2-b三种重组表达质粒，并分别在大肠杆菌屮诱导表达相应的融合蛋白；用全长GST-NDR2蛋白免疫兔，然后用GST-NDR2-A和GST-NDR2-B片段加强免疫;对包涵体形式表达的6His-NDR2进行初步的纯化;利用固定于硝

2、酸纤维素膜上的NDR2抗原亲和吸附纯化抗血清•结果经免疫得到了高效价的兔抗人NDR2多克隆抗血清，亲和纯化提高了NDR2抗体的特异性;免疫组化表明NDR2是一种胞浆蛋白•结论用全长NDR2蛋白免疫兔，再用片段加强免疫，可以提高蛋白的抗原性，制备得到高效价的抗体•纯化后的特异性NDR2抗体，为进一步研究NDR2的功能打下了必要的基础.Keywords:n-mycdownsreamregulator2;genes,myc;genesensitivityandexpression;immunesera;affinitypurifica

3、tion;spedficityAbstract:ATMToobtainananti-NDR2polyc1onalanti-body.METHODSFulllengthofndr2cDNAwasclonedin-topRset-Avectorandtwotruncatedsequencesofiidr^wereclonedintopGEX-4T-lvectorrespectively・Thefusionpro-teinswereexpressedinE.coliandpartiallypurifiedbyinclu-sionbod

4、yfraction.ImmimizationinrabbitswiththewholeNDR2proteinwasreinforcedwithtwotruncatedfragmentsofNDR2twice.Thea.nti-NDR2specificantibodywaspuri-fiedbyabsorbinga.ntiserumwithNDR2antigenimmobi1izedNCfilter・RESULTSHightiterofantiserumagainstNDR2wasobtainedinimmunizedrabbit

5、sandthespecif1citytoNDR2wasincreasedafteraffinitypurification.Immunohis-tochemicaltestwiththisantibodyshowedthatNDR2isacy-toplasmicproteiri.C0NCLUSI0NReinforcementwithtrun-catedNDR2proteinscanstrengthentheantigenicityofNDR2proteininrabbits・ThespecificNDR2antibodycanb

6、eob~tainedbyNCfiIteraffinitypurification・0引言Ndr(N-mycdownstreamregulatedgene)家族是研究N~myc下游调节基因时从小鼠胚胎中发现的一组新基因.目前已报道的成员有4个:ndrl,ndr2,ndr3和ndr4,它们具有较高的同源性，但表达水平在组织发育阶段和分布上差异明显，具体功能还不清楚•人的ndr2是本室于1999年从正常成人全脑cD-NA文库中最先发现并克隆得到•其染色体定位于14qll・2,含有16个外显子，15个内含子;mRNA全长为2024nt,

7、编码含有357个氨基酸残基，Mr约40000的蛋白质.深入研究NDR2在体内的组织细胞和亚细胞水平分布特点及其功能，需要高效价和高特异性的NDR2抗体•为此，我们在大肠杆菌中分别融合表达了全长NDR2蛋白和两个分别含289个氨基酸和198个氨基酸的歹末端的NDR2蛋白片段，并对全长的6H1S-NDR2做了初步纯化.在用全长NDR2蛋白免疫兔后，我们尝试用两个片段NDR2蛋白加强免疫，期望能提高其抗原性;为进一步提高NDR2抗血清的特异性，我们还试着对抗血清做了亲和吸附纯化•高效价和高特异性的NDR2抗体的制备，将为NDR2功能的

8、深入研究提供有力工具和重要线索.1材料和方法1.1材料重组质粒pGEX-4T-l-ndr2由本室构建,JM109,JM109DE3菌种和pGEX-4T-l,pRset-A载体为本室保存;D0C（脱氧胆酸钠）、SKL（十二烷基肌氮酸钠）等购于华美生物技术公司:DN