兔抗乐果抗血清制备的初步实验研究

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1、兔抗乐果抗血清制备的初步实验研究【摘要】目的：对制备兔抗乐果抗血清进行初步研究。方法：釆用生产斥果的中间体硫磷酯与1,4•二氨基丁烷反应合成乐果半抗原，利用碳二亚胺法，将半抗原与牛血清门蛋门(BSA)及卵清蛋口(OVA)偶联，分别制备免疫原和包被原。将合成的免疫原免疫新西兰白兔6次，制备抗乐果的抗血清。用间接ELISA检测抗血清的效价，用间接竞争ELISA检测与其他结构类似物的交叉反应率。结果：通过偶联，获得免疫原和包被原，半抗原与BSA和OVA的偶联比分別为13：1和11：1。免疫原免疫新西兰白兔获得的抗乐果抗血清效价分别为1:256和1：12&与氧化圧果的交叉反应率为23%,与其他所测结构

2、类似的农药交叉反应率均小于2%。结论：通过免疫原免疫新西兰口兔，获得抗乐果的抗血清，但其抗血清效价较低，与制备检测试剂盒的要求尚存在较大的差距。【关键词】乐果；抗血清；效价；交叉反应1材料和方法1」试剂和实验动物：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma产品，牛血清白蛋白(BSA,MW67000).卵清蛋白(OVA,MW45000)、1,4•二氨基丁烷均为Fluka产品，HRP标记的羊抗兔IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。新西兰白兔，雄性，体重2kg左右，浙江省实验动物中心提供，实验动物质量合格证：SCXK(浙)2003-0002号。乐果原药及中间体来自杭州庆丰农化有限公司，各农药标

3、准品为北京舒伯伟化工仪器有限责任公司产品。1.3人工抗原制备：采用碳二亚胺法，将半抗原与牛血清门蛋门(BSA)及卵清蛋口(OVA)偶联，分别制备免疫原和包被原。其屮半抗原・BSA为免疫原,半抗原・OVA为包被原。光谱法测定半抗原、免疫原、包被原、BSA、OVA的吸光値，按文献［2］测定半抗原与载体蛋门的偶联比。1.4动物免疫及抗血清制备：首次免疫用免疫原与等量弗氏完全佐剂进行乳化，按0.5mg/kg体重剂量于兔背部皮内及皮下多点注射。以后每隔3周，用免疫原与等量弗氏不完全佐剂混匀后，加强免疫。先后共免疫6次，共有6只雄性兔子进行免疫。末次免疫后10天心脏采血，分离血清，即为抗血清，・20°C保

4、存。1.5抗乐果抗血清效价测定：采用方阵滴定法确定抗血清最佳工作浓度与包被原最佳包被浓度，间接ELISA测定血清抗体效价。抗血清经稀释后，加入到用包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗兔IgG。间接ELISA测定效价。检测结果为OD490值N阴性对照的2.1倍为阳性。1.6交叉反应率测定:用间接竞争ELISA测定抗血清与其他结构类似物农药氧化乐果、敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、马拉硫磷之间的交叉反应率。将供试物按一定的浓度稀释，建立它们的抑制标准曲线，并计算各□的IC50,再计算交叉反应率。交叉反应率(CR)=IC50(乐果)/IC50(结构类似物)x100%2结果2.1免疫原和

5、包被原的合成：本实验用碳二亚胺法将乐杲半抗原分别与BSA和OVA偶联，分别制备免疫原和包被原。偶联物中半抗原与BSA和OVA的结合比分别为13：1和11：U2.2抗乐果抗血清效价测定结果：木实验共免疫6只雄性兔了，间接ELISA测定抗血清抗体效价(P/N>2.1),4只免疫的兔子未产生抗体，另外2只兔子产生抗血清抗体效价为1：256及1：128,抗体效价较低，与制备检测试剂盒的要求尚有较大的差距。2.3交叉反应率的测定：通过间接竞争ELISA测定，该抗血清与氧化乐杲貝一定的交叉反应率，为23%,与英他所测结构类似的农药交叉反应率均小于2%。3讨论一般农药分子量小于1000,缺乏T细胞表位，无法

6、直接诱导动物机体产生特异性抗体，即无免疫原性。因此，首先需耍农药的结构特征合成半抗原，再将半抗原与载体蛋白偶联合成人工抗原。然后将人工抗原免疫动物及用杂交瘤技术制备针对待测农药小分子的抗血清及单克隆抗体，再进一步制备农药的快速检测试剂盒。自上世纪80年代初，Hammock等［3］首先将免疫分析法用于检测农药残留。Vallejo等［4］于1982年将农药对硫磷与牛血清白蛋白结合制备人工抗原，再将人工抗原免疫兔了产生抗血清，再用ELISA法可检测对硫磷。Ibrahim等⑸采用杂交瘤技术制备出抗对硫磷的特异性单克隆抗体(MeAb),用ELISA法检测对硫磷含量，最低检测量可达1ng/mlo农药残留的

7、免疫分析法是近年來发展起來的分析技术，其突出优点是丽处理过程大为简化，并能达到快速、简便的现场检测要求，正成为一个研究热点［6,7］,并显示岀独特优势。一般情况下，结构较复杂（如含有环状结构）、分子量较大的半抗原在进一步实验屮较易获得免疫成功。Chappey等［8］研究表明，分子量小于300的半抗原难以获得高亲和力的抗体。尤其是没有环状结构（如没冇芳香环、杂环等）或结构不够复朵的半抗原更难于诱导动