兔抗人ndr2高效价抗血清的制备、纯化及鉴定

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1、兔抗人NDR2高效价抗血清的制备、纯化及鉴定关键词:NDR2;基因，Myc表达;免疫血清;亲和纯化;易感性与特异性摘要:目的制备高效价的NDR2抗体.方法构建pRset-A-ndr2，pGEX-4T-1-ndr2-a和pGEX-4T-1-ndr2-b三种重组表达质粒，并分别在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白;用全长GST-NDR2蛋白免疫兔，然后用GST-NDR2-A和GST-NDR2-B片段加强免疫;对包涵体形式表达的6His-NDR2进行初步的纯化;利用固定于硝酸纤维素膜上的NDR2抗原亲和吸附纯化抗血清.结果经免疫得到了高效价的兔抗人NDR2多克隆抗血清，亲和纯化提高

2、了NDR2抗体的特异性;免疫组化表明NDR2是一种胞浆蛋白.结论用全长NDR2蛋白免疫兔，再用片段加强免疫，可以提高蛋白的抗原性，制备得到高效价的抗体.纯化后的特异性NDR2抗体，为进一步研究NDR2的功能打下了必要的基础.　　Keyycdoregulator2;genes，myc;genesensitivityandexpression;immunesera;affinitypurification;specificity　　Abstract:AIMToobtainananti-NDR2polyclonalanti-body.METHODSFulllengthofndr2

3、cDNAmunizationinrabbitsentsofNDR2tmobilizedNCfilter.RESULTSHightiterofantiserumagainstNDR2munizedrabbitsandthespecificitytoNDR2munohis-tochemicaltesticprotein.CONCLUSIONReinforcementycdoregulatedgene）家族是研究N-myc下游调节基因时从小鼠胚胎中发现的一组新基因.目前已报道的成员有4个:ndr1，ndr2，ndr3和ndr4，它们具有较高的同源性，但表达水平在组织发育阶段和分布

4、上差异明显，具体功能还不清楚.人的ndr2是本室于1999年从正常成人全脑cD-NA文库中最先发现并克隆得到.其染色体定位于14q11.2，含有16个外显子，15个内含子;mRNA全长为2024nt，编码含有357个氨基酸残基，Mr约40000的蛋白质.　　深入研究NDR2在体内的组织细胞和亚细胞水平分布特点及其功能，需要高效价和高特异性的NDR2抗体.为此，我们在大肠杆菌中分别融合表达了全长NDR2蛋白和两个分别含289个氨基酸和198个氨基酸的3’末端的NDR2蛋白片段，并对全长的6His-NDR2做了初步纯化.在用全长NDR2蛋白免疫兔后，我们尝试用两个片段NDR2蛋

5、白加强免疫，期望能提高其抗原性;为进一步提高NDR2抗血清的特异性，我们还试着对抗血清做了亲和吸附纯化.高效价和高特异性的NDR2抗体的制备，将为NDR2功能的深入研究提供有力工具和重要线索.　　1材料和方法　　1.1材料重组质粒pGEX-4T-1-ndr2由本室构建，JM109，JM109DE3菌种和pGEX-4T-1，pRset-A载体为本室保存;DOC（脱氧胆酸钠）、SKL（十二烷基肌氨酸钠）等购于华美生物技术公司;DNAmarkerDL2000，PMD18-T载体购于宝生物工程有限公司;ABTS、胶回收和质粒提取试剂盒为华舜生物技术公司产品;PCR引物为赛百盛生物工

6、程公司合成;成年新西兰兔（体质量1.2kg）由第四军医大学动物实验中心提供;HRP标记的羊抗兔二抗购自SantaCruzBiotechnology;D18-T载体.重组质粒（分别命名为PMD18-T-ndr2-a和PMD18-T-ndr2-b）用EcoRI和BamHI酶切鉴定，含预期大小插入片段的重组质粒测序进一步验证.　　1.2.2表达载体的构建用EcoRI和BamHI从pGEX-4T-1-ndr2重组质粒上切下ndr2，并插入pRset-A载体;用同样两个酶从测序验证过的重组质粒PMD18-T-ndr2-a和PMD18-T-ndr2-b上切下两个插入片段，克隆入pGEX

7、-4T-1载体.重组表达质粒用EcoRI和BamHI酶切鉴定，并对pRset-A-ndr2测序验证.　　1.2.3融合蛋白的表达和初步纯化pGEX-4T-1-ndr2，pGEX-4T-1-ndr2-a和pGEX-4T-1-ndr2-b分别转化E.coliJM109，pRset-A-ndr2转化E.coliJM109DE3.用200mLLB（含amp）培养四种阳性重组单菌落，0.1mmolL-1IPTG诱导4h.120gL-1SDS-PAGE分析表达结果.取0.3g表达6His-NDR2融合蛋白的菌体，悬于3mL缓冲