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《兔抗人细胞色素p450 4a11合成肽抗体的制备与鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、兔抗人细胞色素P4504A11合成肽抗体的制备与鉴定论文.freela公司。HRP山羊抗兔IgG购自JacksonImmunoResearch公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECLPlus购自AmershamBiosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、BSA的联接由北京中科亚光生物科技有限公司完成。正常人肝脏组织,由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。1.2方法1.2.1CYP4
2、A11合成肽的设计利用DNAStar软件根据抗原指数(AntigenicIndex)、亲水性结构（HydrophilicityPlot）、柔韧区(FlexibleRegions)及表面概率结构(SurfaceProbabilityPlot)4个参数综合分析CYP4A11序列的特点,确定505～519位15个氨基酸为欲合成的肽序列:RLRRLPNPCEDKDQL。1.2.2CYP4A11肽的合成及其与KLH和BSA的交联CYP4A11合成肽由北京中科亚光生物科技有限公司采用合成肽自动合成仪合成;获得的合成肽经常规C18的RPHPL
3、C柱进行纯化,纯度为96.9%。CYP4A11与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法,将5mg合成肽分别加入7mgKLH和BSA中,边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液（1mL）,室温作用2h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜,交联形成CYP4A11KLH、CYP4A11BSA偶联物。1.2.3兔抗CYP4A11合成肽抗体的制备取200μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮下多点注射,每点约100μg。2周后加强免疫,剂量同前,用不完全福氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮下多点注射;以后隔2周加强免疫
4、1次;从第3次加强免疫开始,每次免疫后7d,经耳中央动脉采血测定抗体的效价,经过4次加强免疫后符合要求时,立即颈动脉采血,分离血清后,无菌分装保存于-80℃备用。1.2.4人肝脏微粒体蛋白制备取正常人的肝脏、剪碎,用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后,加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。采用差速离心（4℃,10000g离心30min,取上清液30000g离心60min,取上清100000g离心60min）,沉淀悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200mL/L甘油,5g/L胆酸钠,2mg/L抑肽酶,2mg/L亮肽素,1mg/L胃酶抑素及1
5、mmol/L苯甲基磺酰氟）中,用Bradford法进行蛋白定量后,置-80℃保存备用。1.2.5辛酸硫酸铵法纯化合成肽抗体用醋酸钠缓冲液（60mmol/L,pH4.0）将抗血清稀释3～4倍,0.1mol/LNaOH调节pH至4.5,缓慢滴加辛酸至浓度为25mL/L,室温搅拌30min。4℃10000g离心30min,弃沉淀后滤膜（0.22μm）过滤,加入1/10体积的10×PBS,用0.1mol/LNaOH调节pH至7.4,缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45%饱和度,混合后4℃过夜。4℃3000g离心30min,弃上清后,用0.01
6、mol/LPBS（pH7.4）重悬,透析过夜。用Branford法进行蛋白定量。经SDSPAGE分离后,用BIORADquantityone软件分析其纯度。1.2.6ELISA检测抗血清效价分别用人肝微粒体蛋白和合成肽BSA偶联物以1mg/L的浓度包被ELISA检测板,每孔100μL,4℃孵育过夜后,用10mL/L小牛血清封闭,37℃2h后,洗涤备用。取出包被好的检测板,每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100μL(对照为正常兔血清),37℃孵育30min,洗涤3次后每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL,3
7、7℃孵育15min,洗涤3次后进行TMB显色,37℃孵育15min,终止反应后,用酶标仪测定样品的A450值。1.2.7间接ELISA检测抗体相对亲和常数用合成肽交联BSA分别以5mg/L和10mg/L的浓度包被ELISA检测板,封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体,再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗,TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标,A值为纵坐标作图。以曲线达到水平时的A值为100%,求出A50即50%A值对应的抗体浓度4。按照Kaff=(n－1)/2(nAb’t－2Abt)算出抗体亲和常数,其中Ab
8、’t、Abt指的是A50时即包被抗原分别为5mg/L和10mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度,Agt、Ag’t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10μg和5μg,n=Agt/Ag’t,本实验中n=2。1.2.8-1。③抗体特异性鉴定:以制备的人肝脏微粒体蛋白、合
