庚型肝炎病毒NS5区部分优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价

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1、申_能和置■，：掌硕士掌伍论文庚型肝炎病毒NS5区部分优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价研究生：丛郁导师：詹美云教授中文摘要庚型肝炎病毒(Hey)是1995年底发现的一种新病原。f在研究其分子生物学、流行病学及致病性等特点的同时，对HGV感染的血清学诊断方法的深入研究，是正确评估其危害和致病性的基础和前提。筛选含优势抗原表位的多肽，是建立HGV抗体的血清学诊断方法的基础，它对于研究血清中抗体的变化，阐明HGV与肿炎的关系●及病毒自身的生物学特征都有十分重要的意义。计算机推导的HGVNS51基多肽的抗原性很强．感染甲期就有表●达，血清抗

2、体的产生早于E2抗体，是HGV感染的早期标志物之一。NS5基因相对保守，不同毒株刺激机体产生的抗体交叉反应性很好，所表达的蛋白可用于血清学检测。目前应用于临床的HGV免疫诊断试剂不少是合成肽抗原，但合成肽片段短，抗原表位较少，重复性差，且无法形成构象型表位，其特异性和敏感性有很大局限性。大量研究结果显示：NS3及NS4区基因重组抗原虽可用于免疫检测，但还有部分HGV感染者NS5区合成肽抗原检测呈单独阳性。因此，NS5区优势抗原表位的表达和抗原性分析对提高HGV感染的检出率具有重要作用。本研究从含有HGV河南株NS5区基因的重组质粒PGCS

3、a及PGC5b中用PCR方法扩增出2段基因：NS5a(6904—7694nt)及NS5b(7526—8032nt)，PCR产物用K1enow酶补平末端后，用BamHI酶切，将它们克隆入pThioC质粒的StuI及BglII酶切位点上，构建成pThSa、pTh5b两个表达质粒。我们设计了简并引物，用PCR引物重中啊怀扣量韩犬举便士芈伍沱文叠延伸法人工合成了与C区合成肽序列相同的约80bp长的碱基，两端分别引入KpnI和XhoI位点，将其克隆至已构建好的pTh5b质粒上(KpnI和XhoI双酶切)，这样c区基因就嵌合至NS5b基因的N端，得到

4、了嵌合表达质粒pThc一5b。经酶切和序列分析鉴定正确，转化至大肠杆菌JMl09(DE3)中，经IPTG诱导表达，分别高效表达出42KD(pTh5a)、35KD(pTh5b)和37KD(pThc一5b)三个重组蛋白。表达产物用渗透性休克法、离子交换层析等方法纯化。采用Western—blot和间接ELISA方法分别对三个重组蛋白的免疫原性进行分析。凝胶成像扫描分析：三个蛋白的最大表达量分别占菌体总蛋白的37．51％(P5a)，34．86％(P5b)，34．70％(Pc一5b)，三种表达蛋白在大肠杆菌细胞内主要以包含体形式存在。纯化后的重组

5、蛋白的纯度分别为93．94％(P5a)、90。25％(P5b)和84．72％(Pc一5b)。P5a、P5b及Pc-5b均能与HGV抗体阳性血清发生免疫印迹反应。在间接ELISA试验中，三个蛋白均能被抗}IGV阳性血清识别。将应用重组蛋白检测的抗HGV抗体与混合重组抗原(包括c区合成肽、NS5a合成肽和NS3区基因重组抗原)的检测结果进行了比较：以混合抗原的检出率为i00％，该三种抗原的总符合率分别为86．9％(P5a)、96．7％(P5b)、88．0％(Pc一5b)。在混合抗原检测为阳性的22份血清中，P5a检出率为68％(15／22)，

6、P5b的检出率为90％(20／22)，Pc一5b的检出率为73％(16／22)；在混合抗原捡测为阴性的70份标本中，P5a检出率为7％(5／70)，P5b的检出率为1％(I／70)，Pc一5b的检出率为6％(4／70)。但三个重组抗原均有单独检出阳性的标本，其中有一部分经RT-PCR检测亦为阳性。i仑X,J、结．广r—njI经鉴定获得了HGV河南株NS5区不同基因片段的3个cDNAjJ表达质粒：pThSa、pTh5b和pThc一5b。＼(副在大肠杆菌中高效表达了P5a(42ki))、P5b(35kO)和／Pc一5b(37km)，掌握了上述

7、三个重组蛋白的诱导表达条，吖件。＼fI甲固铱和置科走掌顽童掌证记文建立了重组蛋白P5a、P5b和Pc一5b的包含体提取和初步纯化方法，获得了纯度较高且有生物活性的基因重组蛋白。对原核表达的ttGVNS5区重组蛋白P5a、P5b和Pc一5b的抗原性进行了初步评价：三个抗原均有较好的特异性和敏感性，与其它区段抗原检测抗一HGV抗体有较高的符合率。仨个重组抗原均有单独检出阳性的标本，其它区段的抗原榆测不到。因此，NS5区基因重组抗原是免疫诊断IrlGV感染的必不可少的成分之一，与其它区段抗原联合应用，可以有效减少样品的漏检。其中，P5a的抗原性

8、较弱于P5b和Pc一5b，融合了c区基因的重组蛋白并未观察到有显著提高HGV抗体的检出水平的作用。h关键词：庚型肿炎病毒，表达，纯化，抗原性赢n__二=彤中曩舔和卫讳_走攀蘑士掌住论文4Exp