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时间:2019-05-16
《庚型肝炎病毒NS5区部分优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、申_能和置■,:掌硕士掌伍论文庚型肝炎病毒NS5区部分优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价研究生:丛郁导师:詹美云教授中文摘要庚型肝炎病毒(Hey)是1995年底发现的一种新病原。f在研究其分子生物学、流行病学及致病性等特点的同时,对HGV感染的血清学诊断方法的深入研究,是正确评估其危害和致病性的基础和前提。筛选含优势抗原表位的多肽,是建立HGV抗体的血清学诊断方法的基础,它对于研究血清中抗体的变化,阐明HGV与肿炎的关系●及病毒自身的生物学特征都有十分重要的意义。计算机推导的HGVNS51基多肽的抗原性很强.感染甲期就有表●达,血清抗
2、体的产生早于E2抗体,是HGV感染的早期标志物之一。NS5基因相对保守,不同毒株刺激机体产生的抗体交叉反应性很好,所表达的蛋白可用于血清学检测。目前应用于临床的HGV免疫诊断试剂不少是合成肽抗原,但合成肽片段短,抗原表位较少,重复性差,且无法形成构象型表位,其特异性和敏感性有很大局限性。大量研究结果显示:NS3及NS4区基因重组抗原虽可用于免疫检测,但还有部分HGV感染者NS5区合成肽抗原检测呈单独阳性。因此,NS5区优势抗原表位的表达和抗原性分析对提高HGV感染的检出率具有重要作用。本研究从含有HGV河南株NS5区基因的重组质粒PGCS
3、a及PGC5b中用PCR方法扩增出2段基因:NS5a(6904—7694nt)及NS5b(7526—8032nt),PCR产物用K1enow酶补平末端后,用BamHI酶切,将它们克隆入pThioC质粒的StuI及BglII酶切位点上,构建成pThSa、pTh5b两个表达质粒。我们设计了简并引物,用PCR引物重中啊怀扣量韩犬举便士芈伍沱文叠延伸法人工合成了与C区合成肽序列相同的约80bp长的碱基,两端分别引入KpnI和XhoI位点,将其克隆至已构建好的pTh5b质粒上(KpnI和XhoI双酶切),这样c区基因就嵌合至NS5b基因的N端,得到
4、了嵌合表达质粒pThc一5b。经酶切和序列分析鉴定正确,转化至大肠杆菌JMl09(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别高效表达出42KD(pTh5a)、35KD(pTh5b)和37KD(pThc一5b)三个重组蛋白。表达产物用渗透性休克法、离子交换层析等方法纯化。采用Western—blot和间接ELISA方法分别对三个重组蛋白的免疫原性进行分析。凝胶成像扫描分析:三个蛋白的最大表达量分别占菌体总蛋白的37.51%(P5a),34.86%(P5b),34.70%(Pc一5b),三种表达蛋白在大肠杆菌细胞内主要以包含体形式存在。纯化后的重组
5、蛋白的纯度分别为93.94%(P5a)、90。25%(P5b)和84.72%(Pc一5b)。P5a、P5b及Pc-5b均能与HGV抗体阳性血清发生免疫印迹反应。在间接ELISA试验中,三个蛋白均能被抗}IGV阳性血清识别。将应用重组蛋白检测的抗HGV抗体与混合重组抗原(包括c区合成肽、NS5a合成肽和NS3区基因重组抗原)的检测结果进行了比较:以混合抗原的检出率为i00%,该三种抗原的总符合率分别为86.9%(P5a)、96.7%(P5b)、88.0%(Pc一5b)。在混合抗原检测为阳性的22份血清中,P5a检出率为68%(15/22),
6、P5b的检出率为90%(20/22),Pc一5b的检出率为73%(16/22);在混合抗原捡测为阴性的70份标本中,P5a检出率为7%(5/70),P5b的检出率为1%(I/70),Pc一5b的检出率为6%(4/70)。但三个重组抗原均有单独检出阳性的标本,其中有一部分经RT-PCR检测亦为阳性。i仑X,J、结.广r—njI经鉴定获得了HGV河南株NS5区不同基因片段的3个cDNAjJ表达质粒:pThSa、pTh5b和pThc一5b。\(副在大肠杆菌中高效表达了P5a(42ki))、P5b(35kO)和/Pc一5b(37km),掌握了上述
7、三个重组蛋白的诱导表达条,吖件。\fI甲固铱和置科走掌顽童掌证记文建立了重组蛋白P5a、P5b和Pc一5b的包含体提取和初步纯化方法,获得了纯度较高且有生物活性的基因重组蛋白。对原核表达的ttGVNS5区重组蛋白P5a、P5b和Pc一5b的抗原性进行了初步评价:三个抗原均有较好的特异性和敏感性,与其它区段抗原检测抗一HGV抗体有较高的符合率。仨个重组抗原均有单独检出阳性的标本,其它区段的抗原榆测不到。因此,NS5区基因重组抗原是免疫诊断IrlGV感染的必不可少的成分之一,与其它区段抗原联合应用,可以有效减少样品的漏检。其中,P5a的抗原性
8、较弱于P5b和Pc一5b,融合了c区基因的重组蛋白并未观察到有显著提高HGV抗体的检出水平的作用。h关键词:庚型肿炎病毒,表达,纯化,抗原性赢n__二=彤中曩舔和卫讳_走攀蘑士掌住论文4Exp
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