庚型肝炎病毒E2区cDNA在毕赤酵母中的表达及抗原性鉴定.pdf

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1、!"卷#期生物工程学报&’()!"*’)##$$#年%月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12+,-./#$$#!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!庚型肝炎病毒!"区#$%&在毕赤酵母中的表达及抗原性鉴定王卓华叶凯徐洪马辉文"（武汉大学药学院生物技术药学系武汉1%$$5#）童立恒彭习亮（武汉市生物技术研究开发中心武汉1%$$%$）摘要利用ABC技术，从含有庚型肝炎病毒（DE&0BFGD&）包膜

2、蛋白9#.H*I（JJ8KL）的质粒LD9M09#中，扩增得到能够编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（DN2）和DE&0BFGD&包膜蛋白9#的融合基因片段。将此长度为!%#1KL的H*I片段插入到酵母表达载体LAOB8P中，使之位于!0因子信号肽下游，且与之同框。通过电激转化将构建的重组表达质粒LAOB8P0DN209#插入到3#0"#+4+&/(*#&DN!!J菌株染色体中。筛选G;QRQ表型的转化子，震荡培养，用+>S$TJU甲醇诱导表达J?后，在培养液中得到表达的DN209#融合蛋白。经过表达条件

3、的优化，DN209#蛋白可占培养液中总蛋白的J$U。通过谷胱甘肽亲和层析柱纯化，DN209#融合蛋白的纯度可达8JU左右。以庚型肝炎病人血清为探针，进行免疫印迹及9VONI实验，结果表明该融合蛋白具有能被庚型肝炎病人血清特异性识别的抗原性。关键词庚型肝炎病毒，9#膜蛋白，巴斯德毕赤氏酵母，表达，抗原性中图分类号W5"文献标识码I文章编号!$$$0%$4（!#$$#）$#0$!"50$4［5，"］庚型肝炎是近年来发现的经血液、体液传染的操作简单，价格低廉等优点。因而，巴斯德毕赤一种新型病毒性肝炎。其病原

4、体是以单股正链氏酵母为表达具有天然抗原性的重组GD&9#蛋白C*I为遗传物质的黄病毒科病毒DE&0BFGD&（即庚提供了一个良好的真核表达环境。型肝炎病毒）。其基因组全长8T!X8T1YK，有一个大本项研究将一段含有GD&9#区.H*I片段的的开放阅读框，能编码约#8$$个氨基酸残基组成的DN2融合蛋白基因插入巴斯德毕赤氏酵母表达载体GD&多聚蛋白质。根据其.H*I序列，该蛋白被划LAOB8P!0因子基因的下游，构建出能过量表达GD&分成*端的9!和9#包膜蛋白区和其后的*N!0*NJ9#0DN2融合

5、基因的重组3)4+&/(*#&。通过对表达条［!X%］J种非结构蛋白区。件的优化，实现了9#蛋白的高表达，得到能被庚型近年来，表达9#区重组蛋白、构建免疫学诊断肝炎病人血清特异性识别的GD&9#蛋白质。试剂一直是DE&0BFGD&免疫学诊断试剂的研究热’材料与方法点。然而，在原核表达系统中虽能获得大量表达的GD&9#蛋白，但是，由于表达的蛋白在翻译后不能’(’质粒，菌株和试剂被正确地折叠和糖基化等翻译后修饰，因而所得到大肠杆菌菌株HGJ!［&)4511",+0Z!48（#"$的GD&9#蛋白免疫原性很

6、差，不能被病人血清中,+0["+!J）"&6C!5*%0I!%$6I!12*I84/"#0!［1］抗GD&抗体免疫识别。一些学者利用重组的病*%,I!］及VE#!（H9%）［"&671+,（!0O/&"J5#$6!［J，4］毒表达载体转染昆虫细胞、小鼠细胞进行表达，7+85$#$J,+0Z&J025基因!）］为本实验室保存。含虽然表达的蛋白具有较好的免疫原性，但其操作繁有GD&9#区.H*I片段的重组质粒L2/;’G;QI09#［8］琐，耗时长，成本高，而且表达量不高。由石建提供。质粒LD9M0JM0

7、!09#为含有9#.H*I甲醇营养型酵母———巴斯德毕赤氏酵母的L2/;’G;QI09#.1,$078+%片段与质粒LD9M0JM0（3#0"#+4+&/(*#&）作为一个新型的真核表达系统，具!的重组体。质粒LAOB8P及3#0"#+4+&/(*#&菌株有蛋白表达量高，表达的蛋白具有天然的免疫原性，DN!!［J"#&1］购自O@;S-’]3@公司。含质粒和不含质收稿日期：#$$!0$"0%!，修回日期：#$$!0!#0!1。"通讯作者。23(："40#50"54"#1"5；6,7："40#50"5

8、4"#%%8；90:,;(：/<:,=)3?>).@#UU生物工程学报#U卷粒的大肠杆菌菌株，分别在!"保藏于含氨苄青霉入冰预冷的$G*A’电转化杯中，冰浴9’BO。用)BC5素（#$$!%&’(）和不含氨苄青霉素的()平板上，每*E@K/<=电激（#9$$3电压，*9!W电容，#$’>）周传代#次。所有!+"#$%&’($菌株均在!"下保藏后，立即加入#’(冰冷的#’CR&(山梨醇溶液，将混于,-.平板上，每*周传代#次。抗/01兔