丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达 (1)

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1、西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：趁邀鲞指导教师签名：图Wg年若月n／日沙石年6月fb日西北大学学位论文独创性声明本人声明

2、：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：弓长欲瘩伊拇Zj{fⅥ英文缩写HCVPBSBSAEUSARmAEDl：AHRPKDLBLLBODPCRPMSF“mlnSDSPAGETrisbpORFHVRE．coliAmpUTRIFN．aIRES缩略词表英文全称hepatiti

3、sCVimsphosphatebuf!feredsalinebovineserumalbuminenzyme—linkedimmunOsOrbent鹬sayrecombinantimmuⅡoblotingassayethylenedi唧inotetmaceticacidhOrseradishperoxidasel【iloDaltonLu“a．BenanimediumLowsaltLIlria—Beftanimediumopticaldensityp01ymerisechainreactiOnphenylmethylsulfoIlylfluori

4、dereVolutionspermi肌tesodiumdodecvlsulfatepoiyacrylamjdegelelectrophoresistrihydroxymethylamino-methaneebasepairopenreadingframehigllvariedre垂onEscherichiacoliAmpicilljnuntranslatedrcgionrecombiⅡanIinterferonaintemalribosomeentrvsite中文译名丙型肝炎病毒磷酸盐缓冲液牛血清白蛋白酶联免疫吸附试验重组免疫印迹试验乙二胺四乙

5、酸辣根过氧化物酶千道尔顿LB培养基LLB培养基光密度聚合酶链式反应苯甲基磺酰氟每分钟转数十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳三羟甲基氨基甲烷碱基对开放阅读框高变区大肠杆菌氨苄青霉素非翻译区重组a干扰素内部核糖体进入位点中文摘要丙型肝炎病毒(H印atitisCvirtls，HcV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因之一。目前尚无有效的疫苗及治疗药物，对Hcv感染的早期诊断是控制HCv传播的重要手段。Hcv感染的临床诊断途径有：检测血清Hc、，ItNA、Hcv抗体及HCv抗原。目前PcR检测HcVI蝌A是HcV诊断最灵敏、特异的方法，但其操作复

6、杂，易造成污染，且价格昂贵，不适于大规模的筛查应用。Hcv患者血清中Hcv抗原水平很低，常规免疫学方法难以获得阳性结果。故HCV诊断最常用的方法是利用H嘴异性蛋白质抗原来筛查血清中Hcv抗体。HcV核心蛋白(core蛋白)高度保守且有很强的免疫原性，可诱发高水平的特异性体液免疫及细胞免疫，是HCv诊断试剂中必不可少的组分之一。近年来Core蛋白先后在大肠杆菌中获得了表达，但是大肠杆菌不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，表达的蛋白往往形成的包涵体，需要经过变性、复性等处理才能应用。与大肠杆菌相比，毕赤酵母是单细胞真核生物，既具

7、有生长快的特点，又能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足，表达外源蛋白可分泌到胞外，便于产品的分离纯化。因此本研究在大肠杆菌系统中表达core蛋白并构建其毕赤酵母表达系统，初步对两个系统表达的Core蛋白进行对比。将克隆有core基因的原核表达载体pBvlLl一core转化大肠杆菌HBl01，温度诱导表达cofe蛋白，进行sDs—PAGE及western．Blot分析；同时通过PcR方法扩增core基因，克隆入表达载体pPIczaA，筛选阳性克隆pPlczaA．core。将经过酶切鉴定和测序正确的阳性克隆电转入毕赤酵母Gsll5巾

8、，挑取酵母转化单菌落，接种于BMGY培养基，30℃、250r／min培养奄OD600=2．O时室温1，500r／min离心5min，用BMMY培养基重