雪莲pebp基因在大肠杆菌和毕赤酵母中表达

《雪莲pebp基因在大肠杆菌和毕赤酵母中表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、新疆农业大学硕士学位论文雪莲PEBP基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达姓名：张学军申请学位级别：硕士专业：植物病理指导教师：艾秀莲;赵震宇20070501中文摘要雪莲PEBP基因是本实验室分离出的新抗寒相关基因，共有5lO个核苷酸，网上进行8LAST对比，与拟南芥(4阳6胁肿妇f妇加H口)中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因类似，相似性8l％。本实验以实验室构建的Te够y-PEBP质粒为模板，扩增PEBP基因，克隆到表达载体pET30(+)和pPIc9k并导入大肠杆菌BL2l(DE3)和毕赤酵母(P砌幻瑚悖fDJ妇)Gsll5细胞内表达，纯化表达产物，优化表达条件，主要结果如下：根据pET

2、30(+)多克隆位点设计PEBP基因特异性引物，引入EcoRI和NcoI酶切位点，以Teasy．PEBP质粒为模板，扩增PEBP基因，连接到原核表达载体pET30(+)上，转化感受态表达菌株BL21(DE3)，在低温下，低浓度IPTG诱导融合蛋白表达，纯化表达产物，westernblot鉴定目的蛋白，sDS．PAGE分析：其相对分子量约为28KD，与预期相符，表达量约占菌体蛋白的26．8％，并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白，westernblot鉴定为阳性。根据pPIC9k多克隆位点设计PEBP基因引物，分别加入EcoRI和NotI酶切位点，以Teasy．PEBP质粒为模板，扩

3、增PEBP基因，克隆到表达载体pPIC9k，得到重组质粒并命名为pPIC9k．PEBP，将pPIc9k．PEBP用salI进行酶切，线性化后的pPIc9k．PEBP以电转化法导入到酵母GSll5细胞中，利用删和胁平板筛选M酊(metll锄olutilizationslow)表型，PcR鉴定重组酵母菌株，乙醇诱导表达。sDS．PAGE分析：其相对分子量约为20KD，蛋白表达量可占总蛋白的90％，上清液抗冻检测表明，PEBP能降低液体的冰点，具有一定的抗冻作用。优化重组质粒pPIC9k-PEBP在毕赤酵母(尸f曲蛔删，o廊)Gsll5中的表达条件，初步得到最佳的重组蛋白表达条件为：诱

4、导剂甲醇浓度为O．5％，诱导培养基的PH为6．O，诱导温度为32℃，诱导时间为216h。实验成功构建了表达载体pET—PEBP和pPIc9k．PEBP，获得了高效表达产物，并为进一步研究雪莲PEBP的抗冻功能奠定基础。关键词：磷脂酰乙醇胺结合蛋白，毕赤酵母，分泌表达，抗冻性，大肠杆菌，雪莲，表达纯化AbstractPEBPg朗eisnewAmi仔∞zcgcnet11a士w笛s印aratedbyourlaboraloryin勋甜s肌口加V甜姗曰胞K觥盯酊，．Thel朗gthofPEBPis510bp，Homolo纠searchwithPEBPwereperfornledagatll

5、stGenBalll【IlsingBLAsT'theidemitywithPEBPof一，曰6蚴括，加矗讲坩we∞8l％．InttIisresearckusing1也玷y-PEBPplasmid舔atempl如，tl艟PEBPgenew勰枷plifiedbyPcR．PEBPgenewasinsencdiIl协pET30a(+)柚dpPIc9kthen既presscdinE．coliBL21锄dp砌妇p缈fn廊Gsll5，佗spectively．111eexprcssion胛Dducbwe犯p晡矗cdbya币n姆chroIna￡咱砷hy，aIldtIleoptimalexpr髂si

6、oncondi廿onw鹞obtainedbyprelimin哪“笃earch．ThemainresuItswereasfbllows：Apairofspec讯c州mersPEBP∞nse柏dPEBPami一鲫lsewe陀dcsigIledbased∞themuMclonesh(Mcs)ofpET30a(+)，im∞“edre啦idionsi钯EcoRI锄dNcoI咒spe吐iveIy．ThePEBPgcnewasampImcd丘omTe砸y-PEBPp1鹊midbyPCR锄dim料tcdiIlto111epEIT30a(+)VoctoL11砖recombinamVectorw舔n

7、彻s向TedintoEcoliBL2l(DE3)柚dindIlcedthe麟pr∞sionofp眦inbylowconcelI眦ionofIPTG柚dlawtelnperan鹏oVenlight．FIIsion肿毗inw笛p嘶矗edbyNi-NTAamn时chr伽a士ogmphy．sDs—PAGE锄dwestemblot锄alysisshowedthalthef缸ion舯咖in佗lativcmolecularweiglltw舔28KDtIlatw嬲consistemwjththe