淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达

《淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、浙江大学动物科学学院硕士学位论文淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达姓名：陈艳申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：孙建义20040501壁兰垡论塞淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母的高效表达中文摘要淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamylotiqu咖c把”J)是一种嗜热菌，其产生的中性植酸酶具有广阔的应用前景。本研究克隆了淀粉液化芽孢杆菌檀酸酶基因，采用表达载体pET-30a(一Vector、pPIC9KVector及其相应的宿主菌EcDli21和PichiapastorisG

2、Sll5对其进行表达，并对表达产物的活性和耐热性能进行了系统性评价。主要研究结果如下：通过对植酸酶基因序列的同源性比较，根据其保守区域设计上游引物5BAP01和下游引物3BAP01。以提取的淀粉液化芽孢杆菌BA基因组为模板，利用TD—PCR技术克隆了淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因BAP，并构建了重组质粒pGEM。-TEasyBAPVector。测序表明，其长度为1167bp，ORF为1Ibp～1159bp，编码383个氨基酸，5’端有一个编码26个氨基酸的信号肽序列，其全长理论分子量为41．9kDa。淀粉液化芽孢杆菌植酸酶基因和已报道的杆菌

3、植酸酶序列具较高同源性，如与AF029053停subtillus)、AF453255(B．amyloliquefaciens)、U85968(Bacillus'spDSll)、AY220075∞．subtillus)、AY055220∞．amyloliquefaciens)、AY518208(Bacillussp．)的DNA序列的同源性分别为100％、96％、92％、92％、92％、92％，所编码蛋白同源性分别达到100％、97％、94％、94％、94％、93％。通过带限靠小陛内切酶位点的弓I物(5BAP01带BamHI位点，3BAP0

4、1带XhoI位点)，将淀粉液化芽孢杆菌编码的中性植酸酶基因定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上，得到重组表达质粒BAP-pET-30a(+)Vector。在大肠杆菌BL21(DE3’中得以表达，SDS—PAGE凝胶电泳显示在50．2kDa处有一特异条带，比推导出的分子量419kDa大。单位发酵液的酶活力为480，6U／ml，表达量占到了大肠杆菌可溶性蛋白的33．5％，为出发菌株酶活的1．27倍。采用金属Ni2+亲和层析对基因表达产物进行纯化，产物具有正常的生物学功能。根据酵母表达载体FPIC9K的多克隆位点和已克隆的中性植酸酶基

5、因限制性内切酶图谱，设计具有SnaBI位点的上游引物5BAPK01和具有NotI位点的下游引物3BAPK01。采用亚克隆技术，将淀粉液化芽孢杼菌植酸酶基因以N一端融合的方式正确插入到酵母表达载体pPIC9K上的Ⅱ一因子信号肽编码序列的3，IV顷上学位论文淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母的高效表达端，构成重组表达载体BAP．pPIC9K。用电击法将经BglII单酶切线性化的BAP．pPIC9K转化入毕赤酵母Gsll5菌株，从而整合到酵母染色体DNA中得到重组转化子。筛选到的基因工程菌经培养后，上清液的发酵活力为4120U

6、／ml，为出发菌株的10．9倍。SDS—PAGE凝胶电泳检测，表达的植酸酶的分子量约为45kDa，这表明植酸酶基因在毕赤酵母得到了高效表达。对两种表达系统的植酸酶生物学特性研究显示，EcoliBAPE菌株与PichiapastorisBAPK菌株表达的淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶具有相似性，最．适反应温度均为65～70。C，属嗜热性酶。其最适反应pH为7．0～715，在6．0～7．5这～范围内，酶活性均在70％以上。pH值稳定性结果表明，植酸酶BAPE和BAPK在pH50～9．0之间极为稳定，残余酶活在85％以上，而pH低于5．0时，酶活性

7、迅速下降，到pH为4．0以下，已无酶活性。热稳定性研究揭示，重组酵母植酸酶BAPK的耐热性优于大肠杆菌植酸酶BAPE，BAPK在70。C和80℃处理2rain，残余酶活为80．54％和68．42％，处理10min的残余酶活分别为7003％和50．69％；而植酸酶BAPE在709C和80℃处理2min，残余酶活为71．02％和40．34％，处理10min后，残余酶活为48．23％和20．12％。由此可以看出，同种基因经两种不同系统表达得到的植酸酶均适合在动物的肠道内发挥作用，重组酵母植酸酶BAPK耐热性更佳。关键词淀粉液化芽孢杆菌；中性植

8、酸酶；基因克隆；大肠杆菌：毕赤酵母；表达；酶学特性V硕士学位论文淀粉液化芽孢杆菌中性植酸酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母的高效表达AbstractBacillusamyloliquefaciensisoneoft