基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达技巧

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1、第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达l前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉

2、价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、

3、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点l一条

4、成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；l基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；lmRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；l基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。原核体系中表达真核基因的困难1.细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；2.真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；3.真核基因一般含有内含子，

5、而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；4.表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。四、构建表达载体的策略⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合

6、多肽切除。第一节基因在大肠杆菌中的高效表达一、大肠杆菌表达载体的成份⑴启动子要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。⑵转录终止子使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。⑶核糖体结合位点在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)筛选标记基因(5)密码子的选择二、常见的大肠杆菌表达系统①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的

7、调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。三、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。1.启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10b

8、p，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-