Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达pa

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1、5.2.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征5.2酵母基因工程（自学）5.2.1.1酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。5.2.1.2酵母菌表达外源基因的优势基因表达调控机理清楚，遗传操作简便具有真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物

2、分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素酵母菌是最简单的真核模式生物5.2.2酵母菌的宿主系统广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌5.2.2.1广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如

3、非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）4.2.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1提高重组蛋白表达转录水平ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-提高重组蛋白表达转录水平突变类型生物效应作用位点4.2.2.3抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖

4、基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型突变类型生物效应许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。4.2.2.4减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aaubiquitinligaseE3LysubiquitinligaseE3Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白酵

5、母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭UBI4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能UBI4缺陷型

6、：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效4.2.3酵母菌的载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒4.2.3.1酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2m环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链环状质粒，拷贝数达50至100个。同源重组REP1RA

7、FSTBoriREP2FLPIRIRAB乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亚基的双链线状质粒pGKL1和pGKL1反向重复序列4.2.3.2酵母菌克隆表达质粒的构建(1)含有ARS的YRp质粒的构建ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达

8、200个，但培养几代以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。(2)含有CEN的YCp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数