真核基因在大肠杆菌中的表达

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1、第六章真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素大肠杆菌表达体系克隆基因正确表达的基本条件克隆基因表达活性的检测1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。优越

2、性：大肠杆菌表达体系3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。大肠杆菌表达体系大肠杆菌中表达体系的不足4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。最基本条件：

3、应该能够进行正常的转录和转译，在正常情况下，还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。克隆基因正确表达的基本条件具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；插入序列的正确取向。1.微细胞检测法；2.巨细胞检测法；3.偶联反应测定法。克隆基因表达活性的检测这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。微细胞：指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。微细胞检测法克隆基因表达活性的检测通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开，含有质粒载体的微细胞是

4、适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。Example:ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）,在微细胞中不能合成出56×103dal、42×103dal、30×103dal、28×103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。克隆基因表达活性的检测一般情况质粒的基因型同微细胞中的多肽是对应的。如果质粒缺失或插入一段序列，则结果难预测。巨细胞检测法1.经紫外线照射的

5、大肠杆菌recAuvrA细胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照射后6小时，细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右，在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。克隆基因表达活性的检测2.将含有外源基因的λ噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤，自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。克隆基因表达活性的检测偶联反应测定法使D

6、NA模板在细菌无细胞体系中，进行转录－转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。克隆基因表达活性的检测优点：1.放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记法高的多，而且这个系统十分敏感。经35S标记的多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出；2.应用这个体系，其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。go大肠杆菌表达载体核糖体结合位点启动子转录终止子复制起点一、表达载体的组成部分最佳

7、启动子具备的条件第一必须是启动子能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上1.启动子第二这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件轮状病毒的VP7蛋白能有效地杀死细胞，因此必须在严格控制的条件下表达第三这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。（IPTG）Example:IPTG野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱

8、导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5P