真核基因在原核细胞中的表达

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1、六.真核基因在原核细胞中的表达辛德东实验目的了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法实验原理外源基因的转录模式组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如果表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响。实验原理表达载体启动子乳糖操纵子抑制基因（I）+启动子（P）+操纵基因（O）+结构基因（ZYA）l

2、acI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因O上从而阻遏转录起始，LacZ编码β半乳糖苷酶（β-galactosidase）。实验原理表达载体启动子乳糖操纵子培养基中有乳糖（lactose）时，乳糖进入细胞后，在β-半乳糖苷酶催化下转化为乳糖的异构物--异乳糖（allolactose）实验原理表达载体启动子乳糖操纵子IPTG是的结构类似物，异乳糖可以被β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖（glucose）和半乳糖（galactose），但是IPTG不会被水解，它可以作为诱导物，诱导基因表达。IPTG进入细胞也不需要透性酶帮助，所以调节IPTG

3、浓度，可以调节蛋白的表达量。实验原理蛋白可经SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED（四乙基乙二胺）作为催化剂，以AP（过硫酸铵）作为引发剂。SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。实验原理由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别

4、。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。不连续系统：浓缩胶和分离胶（胶孔径不同，胶PH不同）。蛋白质浓缩效应：在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly(pI＝6.0)只有很少部分解离成Gly的负离子，而酸性蛋白质也

5、可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。。分子筛效应：蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到

6、影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?