第六章-基因在原核及真核体系中的表达.ppt

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1、第六章基因在原核及真核体系中的表达第一节真核基因在大肠杆菌中的表达DNAProtein一、真核基因在大肠杆菌中的表达1、理论上的困难:遗传机制的差异>基因结构、mRNA结构、转录信号（SD）、细菌蛋白酶、蛋白的后加工>cDNA、使用原核启动子及SD序列、引入突变体2、克隆基因表达的基本条件启动子、SD、正确插入方向3、增强外源蛋白稳定性的途径1977-化学合成脑激素的表达>形成融合蛋白（-内啡肽--半乳糖苷酶）以胰蛋白酶切割-适合链内不含Met的蛋白>低蛋白酶活性突变体>T4phage的pin

2、基因二、原核生物的表达载体1、Lac启动子的表达载体阻遏作用区、CAP作用区、RNA聚合酶作用区2、Trp启动子的表达载体trp启动子、操纵基因、前导序列3、PL启动子的表达载体CI的温敏突变（CI857)-阻遏蛋白在42C失活三、高等真核基因在大肠杆菌中表达的实例1、胰岛素基因在大肠杆菌中的表达>化学合成A、B链，分别融合-半乳糖苷酶，得到-gal-A和-gal-B，活性低>胰岛素原基因的克隆及表达，体外切割祛除C肽2、生长激素四、提高克隆基因表达效率的途径1、启动子的结构对表达效率的影响

3、-35TTGACA-10TATAAT合成启动子tacI(11Lac)tacII(8Lac)-35与-10间17bp最高活性启动子最佳距离的探测目的基因EE启动子A酶切开Bal31酶解AEE目的基因2、转译起始序列对表达效率的影响转译起始的保守序列：AUG、SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖体的结合位点有一个或几个终止密码子、含全部或部分PuPuUUUPuPu其他：SD后的4碱基4A或4T（GC则25%-50%）、起始密码子左边UAU、CUU最好，UUCUCAAGG下降20倍3、启动子同克隆

4、基因间距离对表达效率的影响4、质粒拷贝数对表达效率的影响5、转录终止区对克隆基因表达效率的影响终止区存在的必要性：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级

5、结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子强终止的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选pCP1AproriTcr筛选Apr、Tcs的转化子6、质粒分离的不稳定性对效率的影响质粒分配由par控制>克隆该基因>保持选择压力>反选择：质粒含CI，宿

6、主是溶源化细菌，其噬菌体启动子缺陷7、密码子的使用频率(bias)复习提纲1、真核基因在大肠杆菌中的表达存在的问题及其解决办法。2、真核克隆基因在大肠杆菌中表达的基本条件。3、增强外源蛋白在大肠杆菌中表达稳定性的途径。4、提高克隆基因在大肠杆菌中表达效率的途径。第二节哺乳动物基因工程一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记嘌呤和嘧啶代谢1、嘌呤和嘧啶的生物合成-全程途径和补救途径2、胸腺激酶（thymidinekinasetk）基因选择系统胸苷胸苷一磷酸（1）tk-细胞建立tk-细胞系方法：取代法5-溴

7、尿嘧啶脱氧核苷（BudR）TK+胸腺嘧啶掺入DNA链致死（2）HAT选择法次黄嘌呤(Hypoanthine)氨基蝶呤(Aminopterin)胸苷(Thymidine)二氢叶酸还原酶　←（受氨基蝶呤抑制）二氢叶酸(培养基中成分)－－－/－－→四氢叶酸↓+dGTP(培养基中成分)次黄嘌呤－－－－－－－－－－－－→dATP+dCTP(细胞生存胸苷激酶（TK）胸苷－－－－－－－－－－－－－→TTP必需)TK-则－－/－→3、二氢叶酸还原酶基因选择系统（DHFR）4、氯霉素乙酰转移酶基因选择系统瞬间表

8、达CAT5、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因XGPRT6、氨基糖苷磷酸转移酶APH二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法1、磷酸钙转染技术（1）基本步骤DNA+CaCl2CaCl2-DNA滴加到Hepers-磷酸钙溶液DNA-Ca3(PO4)2转移沉淀到培养细胞层添加剂：甘油二甲基亚砜（DMSO）（2）影响磷酸钙转染效率的因素>DNA的量（高浓度10~50g/ml）>与细胞接触的保温时间>与添加剂作用时间2、DEAE-葡聚糖转染技术（二乙胺基葡聚糖）Diet