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1、木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达摘要:木实验通过克隆木聚糖酶基因到pTE28a表达载体上，转化BL21表达菌株，用IPTG诱导重组菌，跑SDS-PAGE后，在目的条带处冇0的蛋片的表达，用westernblot鉴定该蛋白，确信目的条带是目标蛋白。同时，把目的条带克隆到PPIC9K载体上，转化毕赤酵母表达菌株GS115,卬醇诱导重组酵母，测得木聚糖酶的活性可以达到2.375U/mLo关键字：木聚糖酶；原核表达；真核表达材料与方法菌种来源本实验所用菌种來自于华中农业人学农业微生物国家重点实验室。。。1.2培养基LB培养基：蛋白陈10g/L,酵母抽提物
2、5g/L,氯化钠10g/L,pH7.0YPD培养基:蛋白B20g/L,酵母抽提物10g/L,葡萄糖20g/LBMMY培养基:蛋白月东20g,酵母抽提物:LOg,100ml13.4%YNB,2ml0.02%生物素,5g甲醇，100ml1M的磷酸盐缓冲液(pH6.0),定容至1L1.3菌种的活化将甘油管保存的含空载和口的基因的重组大肠杆菌表达菌株在含有50ug/mL的卡那霉索的固体LB培养基中划线，过夜培养，挑取单菌落到含有50ug/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，培养至对数期，这就是活化的菌株。同时，将廿油管保存的含空载和目的基因的重组毕赤酵母GS
3、115菌株在YPD固体平板上划线，培养至长出单菌落，挑取单菌落到YPD液体培养基中培养至对数期，备用。1.4重组菌的诱导表达1.4.1重组大肠杆菌的诱导表达按1%的接种量把活化好的重组大肠杆菌接到50ml的含有50ug/mL的卡那霉索的液体LB培养基中，37°C培养至0D600二0.6,添加终浓度为O.lmM的IPTG,25°C培养6-8h,离心收集菌体，加PBS溶液重悬破碎，再高速离心，取上清液过Ni柱，收集适当咪卩坐浓度洗脱的蛋白质，跑SDS-PAGE,并做westernblot验证目标蛋口。1.4.2重组酵母细胞的诱导表达按1%的接种量接种于
4、20mlYPD液体培养基中，30°C,250r/min摇瓶16-18h,待OD6oo二2・6时，，5000r/min离心5min收集菌体，将菌体转入50mlBMMY培养基中(用500ml三角瓶，4层纱布封口)，250r/min摇瓶培养，每隔12h补充甲醇浓度至0.5-1.0%(w/v)进行蛋白的表达,并每隔12h取样lml,测ODeoo,离心保留上清备用。诱导96h后收集菌体，终止诱导，离心取上清备用。测定全部样品中木聚糖酶的活性。1・5大肠杆菌表达的蛋白质的Ni柱纯化(1)固定鎳柱，滴完柱屮的乙醇，加3・5ml去离子水洗。(2)至少加5ml(—般
5、为10ml)BindingBuffer平衡。⑶裂解液，即口标蛋口(预先用0.45um膜过滤)，加入柱中。(4)用10-15mlBindingBuffer洗。(5)洗脱,用含20mM、300mM和500mM的咪瞠的ElutionBuffer洗脱,收集300mM浓度的洗脱液。(6)用20%乙醇洗，再用其贮存係柱。1.6SDS-PAGE鉴定大肠杆菌表达的蛋白质及westernblot鉴定1.6・1SDS-PAGE配制分离胶浓度为12%和浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE,配制方式:12%分离胶配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2ml1.5MTr
6、is-HCI(pH8.8)1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸钱0.05mlTEMED0.002ml按这个顺序加入各种溶液，混匀后注入制胶板，加500ul水饱和的止丁醇封胶，待分离胶凝固后，倒掉止丁醇，配制浓缩胶。5%浓缩胶配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33ml0.5MTris-HCI(pH6.8)0.25ml10%SDS0.02ml10%过硫酸鞍0.02mlTEMED0.002mln的蛋白洗脱液用两倍的上样缓冲液等体积混匀，沸水浴5min,上样电泳。80V电泳至分离胶，调节电压为120V,至溟酚蓝指示剂到胶最底部，停止
7、电泳。小心取下分离胶，放入到染色液中染色30-45min,脱色至无背景蛋白条带清晰。162westernblot用GST蛋口做阴性对照，xynB蛋白为阳性对照。将样品和两个对照点样跑SDS-PAGE,电泳完成后切除多余的胶，转移到正点尼龙膜上，4°C下5%脱脂牛奶封闭过夜后，用His标签蛋白的抗体杂交，再用二抗与一抗杂交，DAB显色检测。1・7酵母表达上清液木聚糖酶活性的测定1.7.1木聚糖酶活性标准曲线绘制a＞准确称取烘干至恒重的无水木糖150mg,用容量瓶定容至100ml,配制成10pmol/ml的木糖母液。b、用容量瓶将木糖母液稀释成1.0〜
8、10.0
9、imol/ml的木糖标准液。c、分别取0.5ml的不同浓度的标准液于试管中，以水作为空白对照，分别加入lmlDN
